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Descrição do resistoma de solo de Cerrado stricto sensu e o potencial de dioxigenases metagenômicas na resistência antimicrobiana e em processos de biorremediação

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016.

Main Author: Santos, Débora Farage Knupp dos
Other Authors: Kruger, Ricardo Henrique
Format: Tese
Language: Português
Published: 2016
Subjects:
Cerrados - solos
Biorremediação
Resistência antimicrobiana
Online Access: http://repositorio.unb.br/handle/10482/20570
http://dx.doi.org/10.26512/2016.04.T.20570
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spelling ir-10482-205702019-09-11T17:10:21Z Descrição do resistoma de solo de Cerrado stricto sensu e o potencial de dioxigenases metagenômicas na resistência antimicrobiana e em processos de biorremediação Santos, Débora Farage Knupp dos Kruger, Ricardo Henrique Cerrados - solos Biorremediação Resistência antimicrobiana Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016. Texto liberado parcialmente pelo autor. Conteúdo restrito: Capítulo 2 e Apêndice I. A resistência antimicrobiana tem sido uma grande ameaça à saúde humana, dada a disseminação de genes de resistência a antibióticos (ARGs) em patógenos e micro-organismos clinicamente importantes, promovendo o aparecimento de cepas multirresistentes de difícil tratamento, complicado também pela queda na quantidade de novos antibióticos lançados no mercado. Assim, pesquisas por determinantes genéticos da resistência a antibióticos em isolados clínicos têm sido intensificadas desde os primeiros relatos de resistência antimicrobiana no começo do século XX. Neste contexto, a diversidade ambiental dos ARGs vem sendo subestimada, apesar do conhecimento de que a origem destes genes são os ambientes naturais, em particular o solo. Os micro-organismos presentes nesses ambientes são, em sua maioria, ainda não cultiváveis e consequentemente desconhecidos, o que os torna importantes fontes de novos genes e biomoléculas de interesse biotecnológico. Entretanto, analisar sua totalidade depende de técnicas independentes de cultivo. A metagenômica apresenta-se como uma ferramenta importante, já que acessa os micro-organismos de uma dada amostra ambiental pela extração do seu DNA total, permitindo identificar genes de interesse por abordagem de sequência ou funcional. Na pesquisa por novos ARGs, a metagenômica funcional é de grande valia para identificar novos mecanismos de resistência antimicrobiana e inferir a real diversidade de ARGs no meio ambiente, além de investigar os papéis ecológicos destes genes fora do ambiente clínico. Em trabalho anterior, observou-se a presença de três genes para putativas dioxigenases em dois clones resistentes isolados de biblioteca metagenômica de pequenos insertos (com insertos de 3-8 Kb) construída com DNA de amostras de solo de Cerrado. Nesta Tese, apresentam-se dois capítulos: o primeiro aborda a hipótese de que as dioxigenases putativas estão associadas ao fenótipo resistente observado. Dessa forma, três subclones foram construídos e denominados AMX3(2), AMX3(3) e CRB2(1), para posteriores análises fenotípicas e estruturais, onde CRB2(1) mostrou-se capaz de causar resistência à carbenicilina em Escherichia coli – adicionalmente, também mostrou-se capaz de resistir à ação do fenol. Em análises estruturais e enzimáticas, inferiu-se que o inserto é uma extradioldioxigenase com domínio bicupina, sendo uma provável gentisato 1,2-dioxigenase (GDO). Estas enzimas são importantes no metabolismo de compostos aromáticos, o que as torna potenciais em processos de biorremediação. No segundo capítulo está descrita a análise das sequências de seis clones resistentes isolados de biblioteca metagenômica de grandes insertos (com insertos de mediana de 35 Kb), também construída com amostras de DNA de micro-organismos de solo de Cerrado. A anotação gênica somou um conjunto de dados de aproximadamente 0,27 Mb, num total de 172 prováveis genes. Tais ORFs foram agrupadas em oito diferentes classes, de acordo com funções selecionadas. Dentre elas, 1,2% eram referentes a enzimas previamente relacionadas à resistência antimicrobiana e 5,8% a transportadores, que também são importantes protagonistas na resistência a xenobióticos. Apesar da grande diversidade de funções observadas, a maior parte das ORFs foi anotada como hipotéticas, sendo fontes para descrição de possíveis novos ARGs, assim como de genes de interesse biotecnológico. Essas observações indicam que a diversidade de ARGs em ambientes naturais difere daquela classicamente encontrada em isolados clínicos, o que evidencia a importância em acessar micro-organismos ambientais na tentativa de revelar novos mecanismos de resistência a antibióticos, que vem a enriquecer o conhecimento sobre seus papéis ecológicos e auxiliar pesquisas das indústrias biotecnológicas, como na prospecção de antimicrobianos e em processos de biorremediação. Antimicrobial resistance poses a grave threat to human health given the dissemination of antibiotic resistance genes (ARGs) in pathogens and in clinically important microorganisms, promoting the rise of multiresistant strains of difficult treatment, also aggravated by the decreasing quantity of new antimicrobials launched onto the market. Hence, since the first reports of antimicrobial resistance in the beginning of the 20th century, the research for the genetic determinants of antimicrobial resistance have been intensified. In this context, the environmental diversity of ARGs was underestimated, despite the knowledge that such genes are environmental-born, especially on the soil. The majority of environmental microorganisms are not yet cultivable and remain unknown, being an important source for novel genes and biomolecules of biotechnological interest. However, analyzing them requires culture independent techniques. Metagenomics rise as a powerful tool, since it access the microorganisms from an environmental sample by the extraction of their total DNA, allowing for the identification of genes of interest by sequence and functional approaches. In the search for new ARGs, functional metagenomics is a valuable method to identify novel mechanisms for antibiotic resistance and infer the actual diversity of environmental ARGs, while exploring their ecological roles outside the clinical setting. In a former work, three putative dioxigenase genes were observed in two resistant clones isolated from a small-insert metagenomic library (insert size 3-8 Kb) constructed with DNA samples from Cerrado soil. In this Thesis, two chapters are provided: the former addresses the hypothesis in which putative dioxygenases are involved in the resistant phenotype observed. In this manner, three subclones were constructed and named AMX3(2), AMX3(3) and CRB2(1), for further phenotypical and structural analysis, where CRB2(1) proved resistant to carbenicillin in Escherichia coli – additionally, it was also able to resist the action of phenol. In the structural and enzymatic assays, the insert was presupposed as an extradioldioxygenase with a bicupin domain, most probably a gentisate 1,2-dioxygenase (GDO). These are important enzymes on aromatic metabolism and potential resources in the bioremediation industry. The latter chapter describes the sequence analysis of six resistant clones isolated from a large-insert metagenomic library (insert size around 35 Kb), also constructed with DNA samples from Cerrado soil. Gene annotation comprised a 0.27 Mb dataset, summing 172 probable genes. Such ORFs were grouped in eight different classes, according to preselected functions. Within these, 1.2% were related to enzymatic mechanisms of resistance and 5.8% were classified as transporters, that also play important roles on xenobiotic resistance. Although a great diversity of functions were observed, a greater number of ORFs was classified as hypothetical, being sources for the description of novel ARGs as well as of other genes of biotechnological relevance. These observations imply that the diversity of environmental ARGs differ from that classically observed in clinical isolates, which shows the importance in accessing environmental microorganisms in the attempt to reveal new mechanisms to antibiotic resistance, which may enrich the knowledge on their ecological roles and aid biotechnological researches, such as in antimicrobial bioprospection and in bioremediation processes. 2016-05-27T12:23:24Z 2016-05-27T12:23:24Z 2016-05-27 2016-04-07 Tese SANTOS, Débora Farage Knupp dos. Descrição do resistoma de solo de Cerrado stricto sensu e o potencial de dioxigenases metagenômicas na resistência antimicrobiana e em processos de biorremediação. 2016. 111 f., il. Tese (Doutorado em Biologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2016. http://repositorio.unb.br/handle/10482/20570 http://dx.doi.org/10.26512/2016.04.T.20570 Português Acesso Aberto A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições:Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data. application/pdf
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