Cover Image

Caracterização bioquímica e estudo funcional in vitro da dipeptidil peptidase 8 de Trypanosoma cruzi

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ceilândia, Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências e Tecnologias e Saúde, 2017.

Main Author: Figueiredo, Graziella Santana Feitosa
Other Authors: Bastos, Izabela Marques Dourado
Format: Tese
Language: Português
Published: 2017
Subjects:
Enzimas proteolíticas
Tripanossomatídeos
Bioquímica
Online Access: http://repositorio.unb.br/handle/10482/23477
http://dx.doi.org/10.26512/2017.02.T.23477
Tags: Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
id ir-10482-23477
recordtype dspace
spelling ir-10482-234772021-12-30T20:58:07Z Caracterização bioquímica e estudo funcional in vitro da dipeptidil peptidase 8 de Trypanosoma cruzi Figueiredo, Graziella Santana Feitosa Bastos, Izabela Marques Dourado Enzimas proteolíticas Tripanossomatídeos Bioquímica Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ceilândia, Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências e Tecnologias e Saúde, 2017. A doença de Chagas é endêmica da América Latina, tem como agente etiológico o parasito Trypanosoma cruzi. O tratamento da doença durante a fase crônica gera diversos efeitos colaterais. Nesse sentido, as proteases de tripanossomatídeos têm sido investigadas na busca de novos alvos terapêuticos. A dipeptidil peptidase 8 de Trypanosoma cruzi (DPP8Tc) é uma enzima que faz parte das prolyloligopeptidases, essa família possui membros com conhecida relevância médica, dentre elas está a enzima ortóloga DPPIV humana, cuja inibição é utilizada como uma das formas de tratamento da diabetes tipo II. A DPP8Tc, foi investigada neste trabalho por meio da caracterização bioquímica e por nocaute físico dos alelos do gene dpp8tc do parasito T. cruzi da cepa CL Brener. Os resultados obtidos indicam que a DPP8Tc é uma enzima dimérica, solúvel, ativa em tampão tris 50mM em pH situado entre 7,5 e 8,0 e melhora sua atividade com aditivos. A temperatura ótima para atividade enzimática situa-se em torno dos 28ºC e substrato específico, Gly-Pro-AMC. Com o uso deste substrato, foram obtidos os parâmetros KM de 10,78 μM, Kcat de 1,67x10-3 s-1, Vmax 4,6x10-5 μmol de AMC liberado/min e Kcat/KM:1,55x10μM-1s-1. Os inibidores clássicos de proteases exercem baixa inibição enzimática da DPP8Tc. Em contrapartida, os inibidores de DPPIV exercem maior taxa de inibição entre eles o IB-7, o mais potente, inibe em 96,59% da DPP8Tc, com constante de inibição (Ki) de 8,2 nM. Outros inibidores da DPPIV apresentaram os seguintes ICs-50: KS (IV) com 95,47 nM, IB-4 com 484,9 nM e por último, KAII-23 com 2,7μM. A inibição enzimática ocorre principalmente por inibidores que possuem o grupo adamantil na sua composição química, semelhante à composição do inibidor vidaglipitina da DPPIV humana. A atividade ótima ocorre em torno dos 28ºC, temperatura requerida à sobrevivência da forma epimastigota, indicando potencial função no barbeiro. O nocaute simples do gene dpp8tc, diminuiu em 50% a atividade enzimática, em 20% a fluorescência e aumentou 2,9% a taxa de infecção do parasito DPP8Tc+. As diferenças existentes nas regiões UTRs 5’ e 3’ dos alelos do gene DPP8Tc, impediu o sucesso do nocaute duplo, sendo necessária a construção específica de um cassete direcionado para o nocaute do segundo alelo, visando conhecer por completo a função da DPP8Tc de Trypanosoma cruzi. Chagas disease is endemic in Latin America, and has the parasite Trypanosoma cruzi as its etiological agent. Treatment of the disease during the chronic phase generates several side effects. In this sense, trypanosomatid proteases have been investigated in the search for new therapeutic targets. The dipeptidyl peptidase 8 of Trypanosoma cruzi (DPP8Tc) is an enzyme that is part of the prolyloligopeptidases, this family has members with known medical relevance, among them is the human orthological enzyme DPPIV, whose inhibition is used as one of the forms of treatment of type diabetes II. DPP8Tc was investigated in this work through the biochemical characterization and physical knockout of the dpp8tc gene alleles of the T. cruzi parasite of the CL Brener strain. The results indicate that DPP8Tc is a soluble dimeric enzyme active in 50mM tris buffer at pH between 7.5 and 8.0 and improves its activity with additives. The optimal temperature for enzymatic activity is around 28ºC and specific substrate, Gly-Pro-AMC. With the use of this substrate, KM parameters of 10.78 μM, Kcat of 1.67x10-3 s-1, Vmax 4.6x10-5 μmol of released AMC / min and Kcat / KM were obtained: 1.55x10μM-1s -1. Classical protease inhibitors exert low enzymatic inhibition of DPP8Tc. In contrast, DPPIV inhibitors exert a greater inhibition rate among them, the more potent IB-7 inhibits in 96.59% of DPP8Tc, with inhibition constant (Ki) of 8.2 nM. Other DPPIV inhibitors showed the following ICs-50: KS (IV) with 95.47 nM, IB-4 with 484.9 nM and, finally, KAII-23 with 2.7 μM. Enzymatic inhibition occurs primarily by inhibitors that possess the adamantyl group in their chemical composition, similar to the composition of the human DPPIV vidagliptin inhibitor. The optimal activity occurs around 28ºC, temperature required to the survival of the epimastigote form, indicating potential function in the barber. The simple knockout of the dpp8tc gene, decreased enzyme activity by 50%, fluorescence by 20% and the infection rate of the parasite DPP8Tc+- increased by 2.9%. Differences in the 5 'and 3' UTRs regions of the DPP8Tc gene alleles prevented the success of double knockout, necessitating the specific construction of a cassette directed to the knockout of the second allele, in order to fully understand the function of DPP8Tc from Trypanosoma cruzi. 2017-05-10T10:16:03Z 2017-05-10T10:16:03Z 2017-05-10 2017-02-17 Tese FIGUEIREDO, Graziella Santana Feitosa. Caracterização bioquímica e estudo funcional in vitro da dipeptidil peptidase 8 de Trypanosoma cruzi. 2017. 107 f., il. Tese (Doutorado em Ciências e Tecnologias em Saúde)—Universidade de Brasília, Brasília, 2017. http://repositorio.unb.br/handle/10482/23477 http://dx.doi.org/10.26512/2017.02.T.23477 Português Acesso Aberto A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições:Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data. application/pdf
institution REPOSITORIO UNB
collection REPOSITORIO UNB
language Português
topic Enzimas proteolíticas
Tripanossomatídeos
Bioquímica
spellingShingle Enzimas proteolíticas
Tripanossomatídeos
Bioquímica
Figueiredo, Graziella Santana Feitosa
Caracterização bioquímica e estudo funcional in vitro da dipeptidil peptidase 8 de Trypanosoma cruzi
description Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ceilândia, Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências e Tecnologias e Saúde, 2017.
author2 Bastos, Izabela Marques Dourado
format Tese
author Figueiredo, Graziella Santana Feitosa
author_sort Figueiredo, Graziella Santana Feitosa
title Caracterização bioquímica e estudo funcional in vitro da dipeptidil peptidase 8 de Trypanosoma cruzi
title_short Caracterização bioquímica e estudo funcional in vitro da dipeptidil peptidase 8 de Trypanosoma cruzi
title_full Caracterização bioquímica e estudo funcional in vitro da dipeptidil peptidase 8 de Trypanosoma cruzi
title_fullStr Caracterização bioquímica e estudo funcional in vitro da dipeptidil peptidase 8 de Trypanosoma cruzi
title_full_unstemmed Caracterização bioquímica e estudo funcional in vitro da dipeptidil peptidase 8 de Trypanosoma cruzi
title_sort caracterização bioquímica e estudo funcional in vitro da dipeptidil peptidase 8 de trypanosoma cruzi
publishDate 2017
url http://repositorio.unb.br/handle/10482/23477
http://dx.doi.org/10.26512/2017.02.T.23477
_version_ 1724124883818905600
score 13.657419

Similar Items