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Proteômica funcional da calmodulina na diferenciação dos merozoítos e na invasão eritrocitária de Plasmodium falciparum

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2018.

Main Author: Pinto, Ana Carolline Ribeiro de Toledo
Other Authors: Charneau, Sébastien Olivier
Format: Tese
Language: Português
Published: 2018
Subjects:
Proteínas - análise
Malária cerebral
Plasmodium falciparum
Calmodulina
Interação entre proteínas
Online Access: http://repositorio.unb.br/handle/10482/32885
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spelling ir-10482-328852018-10-22T18:45:25Z Proteômica funcional da calmodulina na diferenciação dos merozoítos e na invasão eritrocitária de Plasmodium falciparum Pinto, Ana Carolline Ribeiro de Toledo Charneau, Sébastien Olivier Proteínas - análise Malária cerebral Plasmodium falciparum Calmodulina Interação entre proteínas Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2018. INTRODUÇÃO: Malária ainda é considerada um grande desafio para a saúde pública; e foi responsável por aproximadamente 438.000 mortes em 2015. Plasmodium falciparum transmite a forma mais complicada da malária em humanos, a malária cerebral. O ciclo intraeritrocitário é o responsável pelo crescimento exponencial da infecção no hospedeiro vertebrado e, consequentemente, pelos sintomas clínicos da doença, o que torna essa etapa um interessante alvo para drogas de combate à doença. Calmodulina (CaM) é um sensor de cálcio ubíquo, importante para sinalização celular. A interação entre CaM e suas parceiras (CBPs) podem ser também essenciais para os processos em P. falciparum, o que torna essas interações interessantes alvos terapêuticos. OBJETIVOS: combinar estratégias bioinformáticas e experimentais para estudo da interação entre PfCaM e suas parceiras, para elucidar novos alvos para o combate à malária. MÉTODOS: Foi realizada um screening virtual baseado no princípio de cross-reference species, visando encontrar parceiros de PfCaM ao estudar suas interações em outras espécies. PfCaM foi expressa heterologamente e purificada por cromatografia do tipo IMAC, eluída com 100mM de imidazol. A cultura de P. falciparum foi enriquecida na fase esquizonte para se estudar as interações feitas por PfCaM, e essa amostra foi usada para ensaios de cromatografia de afinidade à calmodulina e BN-PAGE. RESULTADOS: O screening virtual teve como melhor resultado de CBP para posterior análise a proteína Hsp70-x, a sequência contém um peptídeo conservado na família Hsp70 descrito como ligante à CaM. A expressão heteróloga e purificação de PfCaM foi bem-sucedida, e a proteína está apta para posteriores ensaios de PPI. A interação entre PfCaM e Hsp70-x foi encontrada na cromatografia de afinidade; além disso, interações entre PfCaM e importantes moléculas efetoras que foram encontradas na cromatografia de afinidade foram discutidas. A cromatografia de afinidade à calmodulina mostrou-se uma estratégia interessante para se estudar os parceiros de PfCaM, além de colocar PfCaM como potencial regulador de importantes moléculas efetoras envolvidas na invasão de novas hemácias. A abordagem BN-PAGE foi estabelecida para estudar os complexos em P. falciparum. CONCLUSÕES: a combinação de estratégias bioinformáticas e experimentais mostrou-se uma boa estratégia para se elucidar interações entre proteínas em P. falciparum. Espera-se com esse trabalho ter destacado importantes interações com potencial para alvos terapêuticos visando o combate da malária. Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ), Fundação de Amparo à Pesquisa do Distrito Federal (FAPDF), Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e Comité Français d'Évaluation de la Coopération Universitaire et Scientifique avec le Brésil (COFECUB). BACKGROUND: Malaria is still a big challenge for public health; it was responsible for about 438.000 deaths in 2015. Plasmodium falciparum transmits cerebral malaria, the most severe complication related to a Plasmodium spp. infection in humans. The asexual intraerythrocytic cycle is responsible for increasing infection and, consequently, for clinical symptoms of malaria, reason why it is a target for drug development. Calmodulin (CaM) is a ubiquitous calcium sensor, responsible for important cell signaling processes. Since its structure is conserved among eukaryotes, CaM-binding proteins (CBPs) can be also essential for these processes in Plasmodium spp and, for consequence, good drug targets. AIM: to combine bioinformatical and experimental approaches aiming at studying the interaction between PfCaM and its partners, to elucidate new drug targets to fight against malaria. METHODS: a virtual screening based on cross-reference species information was made, to predict CBPs in P. falciparum. PfCaM was heterologously expressed and purified by IMAC chromatography, eluted with 100mM of imidazole. A P. falciparum cellular culture was enriched in schizont phase, and the final sample was used to perform CaM-affinity chromatography and BN-PAGE approaches; RESULTS: The virtual screening has predicted P. falciparum’s HSP70x as a potential CBP; PfHsp70-x sequence contains calmodulin-binding peptides already described in literature. Heterologous PfCaM was successfully expressed and purified and can perform further PPI assays. It was found an indicative of interaction between PfCaM and PfHsp 70-x by CaM-affinity chromatography; besides, interactions between PfCaM and important molecular effectors involved in invasion of new cells were discussed. Chromatography approach has shown to be an interesting methodology to infer P. falciparum calmodulin-binding partners and pointed PfCaM as a potential regulator of important molecular effectors involved in erythrocyte invasion. BN-PAGE approach was established to study P. falciparum protein complexes. CONCLUSIONS: Combined experimental and in silico approaches seem to be a good strategy to evaluate protein-protein interactions. At the end of this work, we aim at having good potential drug targets for further studies in malaria disease. 2018-10-22T18:45:25Z 2018-10-22T18:45:25Z 2018-10-22 2018-03-29 Tese PINTO, Ana Carolline Ribeiro de Toledo. Proteômica funcional da calmodulina na diferenciação dos merozoítos e na invasão eritrocitária de Plasmodium falciparum. 2018. x, 95 f., il. Tese (Doutorado em Patologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2018. http://repositorio.unb.br/handle/10482/32885 Português Acesso Aberto A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data. application/pdf
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