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Expressão de antígenos de multiepítopo de dengue e zika vírus em planta e baculovírus

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Pós-Graduação em Biologia Microbiana, 2019.

Main Author: Luz, Leonardo Lopes da
Other Authors: Nagata, Tatsuya
Format: Dissertação
Language: Português
Published: 2019
Subjects:
Dengue - diagnóstico
Zika vírus - diagnóstico
Zika vírus
Antígenos
Baculovírus
Online Access: http://repositorio.unb.br/handle/10482/35070
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spelling ir-10482-350702021-03-17T14:23:49Z Expressão de antígenos de multiepítopo de dengue e zika vírus em planta e baculovírus Luz, Leonardo Lopes da Nagata, Tatsuya Ribeiro, Bergmann Morais Dengue - diagnóstico Zika vírus - diagnóstico Zika vírus Antígenos Baculovírus Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Pós-Graduação em Biologia Microbiana, 2019. Dengue virus (DENV) e Zika virus (ZIKV) são arbovírus pertencentes à família Flaviviridae, gênero Flavivirus, que provocam milhões de infecções em todo o mundo. Devido à emergência do ZIKV em áreas endêmicas para o DENV, o diagnóstico clínico não consegue distinguir as viroses devido à similaridade dos sintomas. Além disso, os métodos sorológicos disponíveis no mercado têm baixa especificidade devido à alta similaridade entre as proteínas do DENV e do ZIKV que provocam reatividade cruzada entre os anticorpos anti-flavivírus. Assim sendo, o objetivo deste trabalho foi expressar antígenos de multiepítopo de DENV e ZIKV utilizando sistemas de planta e baculovírus recombinante para desenvolver kit diagnóstico sorológico específico para cada vírus. Os genes de multiepítopos foram desenhados através de alinhamento múltiplo e mapeamento de epítopos. Então, os genes foram clonados em um vetor viral vegetal, o Pepper mild mottle virus (PMMoV) e no vetor baseado em baculovírus para infecção em folhas de Nicotiana benthamiana e células TN5-B de Trichoplusia ni, respectivamente. Após as inoculações, plantas de N. benthamiana foram mantidas por 10 dias em condições favoráveis de crescimento, e as células TN5-B foram cultivadas por 72 horas a 28°C. Em seguida, os extratos de folha e de células TN5-B foram submetidos à análise eletroforética de proteínas e Western blotting. Os antígenos foram confirmados utilizando anticorpos anti-his e, então, foram purificados em gradiente de sacarose por ultracentrifugação para utilização nos ensaios de ELISA. Amostras de soro IgG positivas para DENV e ZIKV foram utilizadas em ELISA indireto. Os resultados mostram que os antígenos produzidos não apresentaram reatividade cruzada entre os soros dos pacientes e, portanto, são ótimos candidatos para o desenvolvimento de testes sorológicos mais específicos. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). Dengue (DENV) and Zika (ZIKV) viruses are arthropod-borned virus that belongs to the family Flaviviridae, Flavivirus genus, that causes millions of infections worldwide. Due to the emergence of ZIKV in endemics areas for DENV, clinical diagnostic cannot distinguish both viruses due to similar symptoms. Furthermore, available serological methods have low specificity due to the high similarity between DENV and ZIKV proteins. In addition, anti-flavivirus antibodies may cross-react with proteins of such viruses. Therefore, the purpose of this work is to express DENV and ZIKV multi-epitope antigens using plant system via Agrobacterium tumefaciens and recombinant baculovirus. Multi-epitope antigens genes were designed using multiple alignment and epitope mapping. Then, genes were cloned in vegetable viral vector Pepper mild mottle virus (PMMoV) and in pFastBac-Amino vector (pFB-A) to further infection in Nicotiana benthamiana leafs and Trichoplusia ni TN5B cells, respectively. After infection, N. benthamiana plants were maintained for 10 days in favorable conditions to their growth while TN5B cells were cultivated at 28ºC for 3 days. Next, western blotting was performed using leaf and TNB5 cells extracts to detect antigens with anti-histidine monoclonal antibody. Antigens were purified using sucrose gradient by ultracentrifugation for use in ELISA. Results shows the antigens produced did not present cross-reactivity between patients’ sera and, therefore, are good candidates for specific serological test development. 2019-07-12T21:02:27Z 2019-07-12T21:02:27Z 2019-07-12 2019-02-26 Dissertação LUZ, Leonardo Lopes da. Expressão de antígenos de multiepítopo de dengue e zika vírus em planta e baculovírus. 2019. 61 f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Microbiana)—Universidade de Brasília, Brasília, 2019. http://repositorio.unb.br/handle/10482/35070 Português Acesso Aberto A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data. application/pdf
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