Cover Image

Produção de quimosina bovina em clones de Komagataella phaffii contendo múltiplas cópias do gene codificador

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2019.

Main Author: Baptistello, Carolina de Souza
Other Authors: Torres, Fernando Araripe Gonçalves
Format: Dissertação
Language: Português
Published: 2019
Subjects:
Quimosina recombinante bovina
Leite - coagulação
Komagataella phaffii
Leveduras - melhoramento genético
Online Access: http://repositorio.unb.br/handle/10482/35242
Tags: Add Tag
No Tags, Be the first to tag this record!
id ir-10482-35242
recordtype dspace
spelling ir-10482-352422019-08-07T18:55:22Z Produção de quimosina bovina em clones de Komagataella phaffii contendo múltiplas cópias do gene codificador Baptistello, Carolina de Souza Torres, Fernando Araripe Gonçalves Marco, Janice Lisboa de Quimosina recombinante bovina Leite - coagulação Komagataella phaffii Leveduras - melhoramento genético Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2019. Quimosina é uma aspartil protease que catalisa a reação de hidrólise da κ-caseína, provocando a coagulação do leite. Esta enzima é amplamente utilizada na indústria queijeira, devido à sua especificidade e baixa atividade proteolítica, o que confere características organolépticas desejáveis e alto rendimento a produção de queijo. Neste trabalho, a quimosina bovina B foi produzida em K. phaffii e purificada. Para obtenção das linhagens contendo múltiplas cópias do gene da quimosina foram utilizados vetores integrativos com o gene CHYM sob o controle do promotor do gene PGK1 e a marca de seleção auxotrófica leu2-d. O cassete de expressão é flanqueado por sequencias de homologia a três loci genômicos: PGK1, 5S rDNA e uma sequências repetitiva do cromossomo 3. Clones selecionados de cada construção foram analisados quanto ao número de cópias, estabilidade genética e produção enzimática em frascos utilizando meios de cultura distintos. Os clones P33 (integração no lócus PGK1), R5 (integração no lócus 5S rDNA) e C32 (integração em uma sequência repetitiva do cromossomo 3) apresentam 20, 23 e 2 cópias respectivamente e todos se mostraram instáveis em meio de cultivo não seletivo. O maior valor de atividade enzimática foi obtido em meio YPD para clone C32 (183 UAC.mL-1). A quimosina recombinante foi purificada por cromatografia de gel filtração e analisada por SDS-PAGE. Foram encontradas duas formas da quimosina recombinante, uma com massa molecular de ~36 kDa, correspondente à enzima ativa e uma com massa molecular maior que corresponde a enzima glicosilada. Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Chymosin is an aspartic protease that catalyzes the hydrolysis reaction of k-casein, causing the milk clotting. This enzyme is widely used in the cheese industry, because its high specificity and low proteolytic activity, which gives desirable organoleptic properties and higher yield of cheese production. In this work, the bovine chymosin was produced in K. phaffii and purified. To obtain the strain containing multi-copy of chymosin gene integrative vector with CHYM gene under control of PGK1 promoter and the auxotrophic selection marker leu2-d have been used. The expression cassette is flanked by homology sequences to three target genomic loci: PGK1, 5S rDNA or a repetitive sequence of chromosome 3. Select clone of each construction was analyzed for copy number, genetic stability and the enzymatic production in flask using different culture media. The clones P33 (integration at the PGK1 locus), C32 (integration at repetitive sequence of chromosome 3) e R5 (integration at 5S rDNA) showed 20, 23 e 2 copies respectively and were unstable in non-selective culture media. The highest enzymatic activity was obtained in YPD media by C32 clone (183 UAC.mL-1). The recombinant chymosin was purified by gel filtration chromatography and analyzed by SDS-PAGE. Two forms of recombinant chymosin were found, one with molecular weight of ~36 kDa, which corresponds to active enzyme and another with higher molecular weight which corresponds to active and glycosylated enzyme. 2019-08-07T18:55:22Z 2019-08-07T18:55:22Z 2019-08-07 2019-03-11 Dissertação BAPTISTELLO, Carolina de Souza. Produção de quimosina bovina em clones de Komagataella phaffii contendo múltiplas cópias do gene codificador. 2019. vii, 65 f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2019. http://repositorio.unb.br/handle/10482/35242 Português Acesso Aberto A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data. application/pdf
institution REPOSITORIO UNB
collection REPOSITORIO UNB
language Português
topic Quimosina recombinante bovina
Leite - coagulação
Komagataella phaffii
Leveduras - melhoramento genético
spellingShingle Quimosina recombinante bovina
Leite - coagulação
Komagataella phaffii
Leveduras - melhoramento genético
Baptistello, Carolina de Souza
Produção de quimosina bovina em clones de Komagataella phaffii contendo múltiplas cópias do gene codificador
description Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2019.
author2 Torres, Fernando Araripe Gonçalves
format Dissertação
author Baptistello, Carolina de Souza
author_sort Baptistello, Carolina de Souza
title Produção de quimosina bovina em clones de Komagataella phaffii contendo múltiplas cópias do gene codificador
title_short Produção de quimosina bovina em clones de Komagataella phaffii contendo múltiplas cópias do gene codificador
title_full Produção de quimosina bovina em clones de Komagataella phaffii contendo múltiplas cópias do gene codificador
title_fullStr Produção de quimosina bovina em clones de Komagataella phaffii contendo múltiplas cópias do gene codificador
title_full_unstemmed Produção de quimosina bovina em clones de Komagataella phaffii contendo múltiplas cópias do gene codificador
title_sort produção de quimosina bovina em clones de komagataella phaffii contendo múltiplas cópias do gene codificador
publishDate 2019
url http://repositorio.unb.br/handle/10482/35242
_version_ 1641989066962501632
score 13.657419

Similar Items