Produção de Virus Like Particles do vírus da febre amarela e do vírus Mayaro em células de inseto
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2020.
| Main Author: | Rodrigues, Bruno Milhomem Pilati |
|---|---|
| Other Authors: | Ribeiro, Bergmann Morais |
| Format: | Dissertação |
| Language: | Português |
| Published: |
2020
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| Subjects: | |
| Online Access: |
https://repositorio.unb.br/handle/10482/38670 |
| Tags: |
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ir-10482-386702021-01-27T19:26:56Z Produção de Virus Like Particles do vírus da febre amarela e do vírus Mayaro em células de inseto Rodrigues, Bruno Milhomem Pilati Ribeiro, Bergmann Morais Morgado, Fabricio da Silva Baculovírus Flavivirus Vírus da febre amarela Alphavirus Virus mayaro Albovirus Virus Like Particles (VLPs) Vacinas Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2020. Baculovírus são um grupo de vírus extensamente estudados utilizados como controle biológico de pragas agrícolas, e como ferramenta biotecnológica para expressão de proteínas heterólogas. O vírus infecta naturalmente e exclusivamente insetos, sendo a sua manipulação laboratorial extremamente segura. Sua utilização como vetor para expressão em células de inseto apresenta diversas vantagens, como a capacidade do genoma viral de comportar a inserção de grandes segmentos de DNA de interesse, assim como a ocorrência de modificações pós-traducionais mais complexas ocorridas nas células eucarióticas. Essa tecnologia possuí ampla utilização na indústria para produção proteínas antigênicas de diversos patógenos, com aplicações vacinais e de diagnóstico. Uma estratégia atualmente muito promissora para desenvolvimento de vacinas é a produção e utilização de VLPs (“Virus like particles”). VLPs são partículas que utilizam da capacidade de automontagem de proteínas estruturais de vírus para formação de estruturas que se assemelham a estrutura de partículas virais, porém não possuem material genético e, consequentemente, não são capazes de ocasionar infecção. O sistema de expressão usando baculovírus em células de inseto já foi utilizado para produção de VLPs de diversos vírus, o que resultou no desenvolvimento de vacinas comerciais contra o papiloma vírus humano. Neste trabalho, foram construídos baculovírus recombinantes como ferramentas para expressão de proteínas, e produção de VLPs de dois vírus transmitidos por artrópodes (arbovírus): vírus da febre amarela (“Yellow fever vírus” – YFV), membro do gênero flavivirus, e do vírus Mayaro (MAYV), membro do gênero alphavirus. No capítulo 1 é descrita a construção de baculovírus utilizando de estratégias de controle temporal da expressão gênica, para coexpressão de proteínas não-estruturais (proteínas NS2A, NS2B e NS3), e proteínas estruturais (C, prM e E) do YFV. Isso foi feito com o objetivo de induzir a maturação das proteínas estruturais virais, e formação de estruturas complexas. A infecção dos baculovírus recombinante em células Tn5B levou a indução de fusão de membranas celulares bastante evidente, efeito citopático claro conhecido da atividade da proteína de envelope viral E de flavivirus. Essa indução de fusão de membranas foi exacerbada pela coexpressão de ambas as proteínas não-estruturais e estruturais, se comparada a expressão individual das proteínas estruturais, indicando importante papel de complementação para produção de proteínas maduras com alta atividade fusogênica. Análises de microscopia eletrônica de transmissão (MET) revelaram a formação de partículas que se assemelham a vírions do YFV em estruturas membranosas citoplasmáticas, e da presença de partículas no meio de cultura de células infectadas. O capítulo 2 descreve a construção de baculovírus recombinantes contendo genes estruturais do MAYV (C, E3, E2, 6k e E1). Foi confirmada a expressão das proteínas em células de inseto por Western blot, mostrando o processamento da poliproteína e liberação da proteína de envelope E1 clivada, assim como da proteína de capsídeo C. A localização celular destas proteínas virais foi analisada por imunomarcação e microscopia de fluorescência, indicando a concentração da proteína E1 na membrana celular, e da proteína C no núcleo. Análise do meio de cultura de cultura de células infectadas por contrastação negativa em MET, após ultracentrifugação, indicou a presença de partículas com as dimensões esperadas de vírions de alphavirus. Este trabalho reforça a flexibilidade do sistema de expressão de baculovírus em células de inseto para produção de antígenos de arbovírus emergentes que podem ter grande impacto na saúde pública. CAPES Baculoviruses are a group of viruses extensively studied and utilized as biological control agents of agricultural pests, as well as biotechnological tools for the expression of heterologous proteins. Baculoviruses naturally and exclusively infect only insects, making their laboratory manipulation extremely safe. Its use as a vector for the expression of proteins in insect cells provides several advantages, such as the capacity of the large viral genome to tolerate the insertion of large DNA segments of interest, and the occurrence of more complex post-translational modifications that occur in eukaryotic cells. This technology has ample use in industry for the production of antigenic proteins of several pathogens, with diagnostic and vaccine applications. One strategy that is currently very promising for the development of vaccines is the production e utilization of VLPs (“Virus like particles”). VLPs are particles that utilize the capacity of self-assembly of viral structural proteins, to form structures that closely resemble that of viral particles, but do not possess any viral genetic material, and are therefore unable to cause infection. The baculovírus in insect cells expression system has been used for the production of VLPs of several viruses, with commercial vaccines against the human papilloma virus already available. In this work, recombinant baculoviruses were constructed as tools for the expression of proteins and formation of VLPs of two arthropod borne viruses (arboviruses): the yellow fever virus (YFV), member of the genus flavivirus, and of Mayaro virus (MAYV), member of the genus alphavirus. In chapter 1 it is described the construction of recombinant baculoviruses utilizing strategies for temporal control of the gene expression, for the co-expression of non-structural proteins (NS2A, NS2B and NS3), and structural proteins (C, prM and E) of YFV. This was done with the goal of inducing the maturation of viral structural proteins, and the formation of complex structures. Recombinant baculoviral infection of Tn5B cells lead to the induction of very evident membrane fusion, a clear known cytopathic effect of the activity of the flavivirus envelope protein E. This induction of membrane fusion was severely exacerbated by the co-expression of both the non-structural and structural proteins, when compared to the individual expression of structural proteins, indicating the complementation role for the production of mature proteins with high fusogenic activity. Transmission electron microscopy (TEM) analysis revealed the formation of particles that resemble YFV virions in cytoplasmic membranous structures, and the presence of particles in the infected cells culture medium. Chapter 2 describes the construction of recombinant baculoviruses containing the structural genes of MAYV (C, E3, E2, 6k and E1). Protein expression in insect cells was confirmed by Western blotting, showing the processing of the polyprotein and production of cleaved E1 envelope protein, as well as the capsid protein C. Cellular localization of these proteins were analyzed by immunostaining and fluorescence microscopy, indicating the concentration of E1 protein in the cellular membrane and, the C protein in the nucleus. Infected cell culture medium analyzed by negative staining, after ultracentrifugation, indicated the presence of particles with the dimensions expected for alphavirus virions. This work reinforces the flexibility of the baculovírus in insect cells expression system for the production of antigens of emerging arbovirus that pose a severe public health risk. 2020-07-01T19:25:08Z 2020-07-01T19:25:08Z 2020-07-01 2020-02-10 Dissertação RODRIGUES, Bruno Milhomem Pilati. Produção de Virus Like Particles do vírus da febre amarela e do vírus Mayaro em células de inseto. 2020. 103 f., il. Dissertação (Mestrado em Patologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2020. https://repositorio.unb.br/handle/10482/38670 Português Acesso Aberto A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data. application/pdf |
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