Staff View: Proteína multiepitopo recombinante para o desenvolvimento de kit de diagnóstico para hepatite C

Proteína multiepitopo recombinante para o desenvolvimento de kit de diagnóstico para hepatite C

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2011.

Main Author:	Santos, José Carlos dos
Other Authors:	Torres, Fernando Araripe Gonçalves
Format:	Dissertação
Language:	Português
Published:	2021
Subjects:	Hepatite C Hepatite C - aspectos genéticos Hepatite C - diagnóstico
Online Access:	https://repositorio.unb.br/handle/10482/40985
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id	ir-10482-40985
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spelling	ir-10482-409852021-05-23T22:18:02Z Proteína multiepitopo recombinante para o desenvolvimento de kit de diagnóstico para hepatite C Santos, José Carlos dos Torres, Fernando Araripe Gonçalves Felipe, Maria Sueli Soares josecarlosbiomol@gmail.com Hepatite C Hepatite C - aspectos genéticos Hepatite C - diagnóstico Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2011. O vírus da hepatite C (HCV) é um importante patógeno humano afetando 3% da população humana. A infecção crônica é frequente sendo uma das principais causas de cirrose hepática e carcinoma hepatocelular. Estudos de soroprevalência indicam que pelo menos 200 milhões de pessoas tenham sido infectadas no mundo sendo que somente no Brasil aproximadamente 2 milhões de casos foram relatados até 2003. Vários kits de diagnóstico baseados EIA (Enzyme immunoassay) estão disponíveis no mercado para a detecção de anticorpos anti-HCV no plasma. No entanto, devido à distribuição geográfica distinta de todos os genótipos do HCV no mundo, estes kits nem sempre apresentam um bom desempenho nas diferentes localidades do mundo. Atualmente, esses kits utilizam antígenos peptídicos (kits de terceira geração) ou antígenos recombinantes (kits de quarta geração) de ambas as regiões, estruturais e não estruturais, da proteína viral. A exigência de múltiplos peptídeos e/ou múltiplas proteínas recombinantes para o diagnóstico confiável de infecção pelo HCV aumenta o custo destes kits. A fim de reduzir o custo de fabricação e aumentar a especificidade dos kits de detecção de HCV desenvolvemos uma cadeia única de proteína multiepitopo recombinante composta de várias partes das regiões estruturais e não estruturais da proteína viral. Este gene sintético, com 948 pb, e que codifica para uma proteína multiepitopo HCV (denominado r-MEHCV) foi clonado no vetor pET21a. Células de Escherichia coli BL21 (λDE3) foram transformadas com o plasmídeo resultante e a expressão induzida com 1 mM IPTG. Após 8 h de indução, uma proteína com massa molecular aparente de ~37 kDa foi observada. A proteína recombinante foi purificada até homogeneidade por meio de uma única etapa por cromatografia de afinidade com resina Ni-NTA. A expressão bem-sucedida, assim como os ensaios realizados com a construção de um ELISA “caseiro” baseado na r-MEHCV, no quais amostras de soros reagentes e não reagentes para HCV e reagentes para outras patologias foram analisadas, mostraram que esta proteína pode ser utilizada para o desenvolvimento de um autêntico kit brasileiro para fins de diagnóstico da hepatite C. Análises de dicroísmo circular em pH 7 e 8 mostraram que essa proteína apresenta um padrão de dobramento compatível com estruturas secundária e terciária. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). Hepatitis C virus (HCV) is an important human pathogen affecting 3% of the human population. Chronic infection is frequent and is a major cause of liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Seroprevalence studies suggest that at least 200 million individuals have been infected worldwide. In Brazil, approximately 2 million acute cases of hepatitis C have been report till date. Several EIA (Enzyme immunoassay) based diagnostic kits are available in the market for the detection of anti-HCV antibodies in plasma. However, due to the distinct geographical distribution of all HCV genotypes worldwide, these kits do not always perform equally well in different parts of world. Currently, these kits use peptide antigens (third generation kits) or recombinant antigens (fouth generation kits) from both structural and non-structural regions of the viral protein. The requirement of multiple peptides and/or multiple recombinant proteins for reliable diagnosis of HCV infection adds to the cost of these EIA kits. In order to reduce manufacturing cost and extend the specificity of HCV detection kits we have designed a single-chain recombinant multiepitope protein, consisting of several epitopes from structural and non-structural regions of the viral protein. This synthetic gene with c. 948-pb which encodes the HCV multiepitope protein (rMEHCV) was cloned into pET21a vector. The resulting vector was named pETMEHCV. Escherichia coli BL21 (λDE3) was transformed with the resulting plasmid. A bacterial clone was induced with 1 mM IPTG and the time course of induction after 8h showed a protein with an apparent molecular mass of ~37 kDa. The recombinant protein was purified to homogeneity from disrupted cells by a single step Ni-NTA chromatography. The successful expression, as well as the tests performed with the construction of an “in house” ELISA based on r-MEHCV, in which serum samples reactive and non reactive for HCV and serum reactive with other pathologies were analyzed, shows that this protein may be used for development of a genuine Brazilian hepatitic C kit for diagnostic purposes. Analyses of circular dichroism at pH 7 and 8 showed that this protein has a folding pattern consistent with secondary and tertiary structures. 2021-05-23T22:18:02Z 2021-05-23T22:18:02Z 2021-05-23 2011-03-31 Dissertação SANTOS, José Carlos dos. Proteína multiepitopo recombinante para o desenvolvimento de kit de diagnóstico para hepatite C. 2011. vii, 63 f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2011. https://repositorio.unb.br/handle/10482/40985 Português Acesso Aberto A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data. application/pdf
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Proteína multiepitopo recombinante para o desenvolvimento de kit de diagnóstico para hepatite C

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