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Identificação e isolamento dos compostos bioativos da secreção de Rhinella mirandaribeiroi (Bufonidae)

Dissertação (mestrado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2021.

Main Author: Torres, Daniella Emidio
Other Authors: Pires Júnior, Osmindo Rodrigues
Format: Dissertação
Language: Português
Published: 2021
Subjects:
Anfíbio
Anuro
Secreção cutânea
Sapo
Amina biogênica
Dehidrofufotenina
Online Access: https://repositorio.unb.br/handle/10482/41685
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spelling ir-10482-416852021-08-13T17:21:31Z Identificação e isolamento dos compostos bioativos da secreção de Rhinella mirandaribeiroi (Bufonidae) Torres, Daniella Emidio Pires Júnior, Osmindo Rodrigues Anfíbio Anuro Secreção cutânea Sapo Amina biogênica Dehidrofufotenina Dissertação (mestrado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2021. A secreção cutânea dos anfíbios apresenta um mecanismo de defesa inata, sendo constituída por inúmeros compostos bioativos de várias classes moleculares e o papel dessa defesa passiva é, principalmente, contra microrganismos, predadores e injúrias bioquímicas. A secreção cutânea da família Bufonidae é rica em compostos de baixa massa molecular como aminas biogênicas, esteroides e alcaloides, mas também podem ser encontrados peptídeos e proteínas, e muitos possuem importantes funções farmacológicas. O Brasil é o território com a maior diversidade de anfíbios do mundo, uma dessas espécies é a Rhinella mirandaribeiroi (Cururuzinho), um anuro da família Bufonidae, ainda é pouco explorada como alvo de estudos bioquímicos. Portanto, este trabalho teve como objetivo analisar a secreção cutânea de Rhinella mirandaribeiroi, para a identificação e caracterização de compostos bioativos. Primeiramente foram analisadas as atividades bioativas do extrato aquoso da secreção bruta, onde se obteve resultado de parcial inibição no crescimento de células bacterianas de Escherichia coli (39%) e células fúngicas de Candida albicans (41%); IC50 igual a 3,2, 4,6 e 5,6 mg/mL para as linhagens B16F10, HeLa e MCF-7, respectivamente; parcial atividade fosfolipásica e antioxidante. Posteriormente a secreção foi fracionada por Cromatografia Liquida de Alta Performance (HPLC) e obteve-se 24 frações. Foram realizados os ensaios antibacteriano e antifúngico para todas as frações. Considerando uma inibição de crescimento aproximadamente maior que 95%, obtivemos 4 frações que inibiram o crescimento de células bacterianas e 11 frações que inibiram células fúngicas. Foram purificados e caracterizados 3 compostos de principal interesse. O composto chamado de Fração RRM-22.6 observamos se tratar de uma fosfolipase do tipo A2 que possui aproximadamente 14 KDa e inibiu parcialmente células fúngicas de C.albicans em 61%. A Fração RRM-12.5 sugerimos ser um esteroide bufadienolídeo de 415 m/z, possivelmente uma bufotalinina ou 19-oxo-desacetylcinobufagina, que inibiu parcialmente o crescimento de células bacterianas (E. coli e S. aureus), inibiu em 80% o crescimento de células fúngicas (C. albicans), além de ter atividade antioxidante. A Fração RRM-5.1 sugerimos se tratar de uma amina biogênica, especificamente uma indolquilamina de 203 m/z, a dehidrobufotenina, que teve alta atividade antioxidante nos ensaios de redução do ferricianeto, FRAP e MTT; por citometria de fluxo, manteve as células de MCF-7 viáveis e teve ação protetora para as células contra a atividade apoptótica de H2O2; teve atividade de inibição de crescimento em quase 100% contra células bacterianas de Staphylococcus aureus e 80% contra Escherichia coli. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior. (CAPES). The skin secretion of amphibians presents an innate defense mechanism, consisting in a numerous bioactive compound of various molecular classes and the role of this passive defense is mainly against microorganisms, predators and biochemical injuries. The skin secretion of the Bufonidae family is rich in low molecular weight compounds such as biogenic amines, steroids, alkaloids, but also peptides, proteins and they all have important pharmacological functions. Brazil is the territory with the greatest diversity of amphibians in the world and one of these species is Rhinella mirandaribeiroi (Cururuzinho), an anuran of the family Bufonidae that is still poorly explored as a target for biochemical studies. Therefore, this work aimed to analyze the skin secretion of Rhinella mirandaribeiroi, for the identification and characterization of bioactive compounds. Firstly, the bioactivities of the aqueous extract of the skin secretion were analyzed, where we obtained results of partial inhibition in the growth of Escherichia coli bacterial cells (39%) and Candida albicans fungal cells (41%); IC50 equal to 3.2, 4.6 and 5.6 mg/mL for B16F10, HeLa and MCF-7, respectively; partial phospholipase and antioxidant activity. Subsequently, the secretion fractionated by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) eluted 24 fractions. Antibacterial and antifungal assays were performed for all fractions. Considering a growth inhibition approximately greater than 95%, we obtained 4 fractions that inhibited the growth of bacterial cells and 11 fractions that inhibited fungal cells. Were purified and characterized three compounds of main interest. The compound called Fraction RRM-22.6 was identified as a phospholipase A2 that has approximately 14 KDa and partially inhibited C.albicans fungal cells by 61%. Fraction RRM-12.5 we suggested to be a bufadienolide steroid at 415 m/z, possibly a bufotalinin or 19-oxo-desacetylcinobufagin, which partially inhibited the growth of bacterial cells (E. coli and S. aureus), inhibited the growth of fungal cells (C. albicans) by 80%, and also had antioxidant activity. The fraction RRM-5.1 we suggested to consist of a biogenic amine, specifically an indolalkylamine of 203 m/z, the dehydrobufotenin. Which had high antioxidant activity in ferricyanate reduction, FRAP and MTT assays; by flow cytometry, it kept MCF-7 cells viability and had protective ability to cells against H2O2 apoptotic activity; it had almost 100% growth inhibition activity against Staphylococcus aureus bacterial cells and 80% against Escherichia coli. 2021-08-13T17:21:02Z 2021-08-13T17:21:02Z 2021-08-13 2021-04-29 Dissertação TORRES, Daniella Emidio. Identificação e isolamento dos compostos bioativos da secreção de Rhinella mirandaribeiroi (Bufonidae). 2021. 121 f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Animal) — Universidade de Brasília, Brasília, 2021. https://repositorio.unb.br/handle/10482/41685 Português Acesso Aberto A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data. application/pdf
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