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Estabelecimento e Cultivo de Células em Suspensão e Uso de Biorreatores como Estratégias de Propagação de Bambus do Gênero Guadua

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Botânica, Programa de Pós-Graduação em Botânica, 2020.

Main Author: Queiroz, Fernanda Furlan
Other Authors: Scherwinski-Pereira, Jonny Everson
Format: Tese
Language: Português
Published: 2021
Subjects:
Poaceae
Bambusoideae
Guadua
morfogênese
sistemas de cultivo
análises bioquímicas
Online Access: https://repositorio.unb.br/handle/10482/42251
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spelling ir-10482-422512021-11-04T16:35:33Z Estabelecimento e Cultivo de Células em Suspensão e Uso de Biorreatores como Estratégias de Propagação de Bambus do Gênero Guadua Queiroz, Fernanda Furlan Scherwinski-Pereira, Jonny Everson Poaceae Bambusoideae Guadua morfogênese sistemas de cultivo análises bioquímicas Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Botânica, Programa de Pós-Graduação em Botânica, 2020. Este trabalho teve por objetivo aperfeiçoar técnicas de multiplicação clonal in vitro de Guadua magna e Guadua aff. chaparensis, desenvolvendo estudos relacionados à calogênese, embriogênese somática e cultura de células em suspensão, além de avaliar a aplicação de biorreatores em etapas do processo. Investigações anatômicas e histoquímicas, além de análises moleculares, também foram realizadas para melhor caracterizar as diferentes etapas envolvidas nos processos estudados. Para tanto, inicialmente foi realizada a indução da calogênese em explantes formados por segmentos nodais, segmentos internodais e bainhas foliares de plantas estabelecidas in vitro de G. magna. Os explantes foram submetidos à meio de cultura de MS suplementado com dicamba, 2,4-D e picloram nas concentrações de 0; 6,77; 13,54; 20,31 e 27,08 μM. Aos 60 dias de cultivo, verificou-se que todos os tratamentos apresentaram formação de calos de coloração branco-amarelada e de aspecto mucilaginoso. A análise histológica revelou zonas meristemáticas com células em intensa divisão e formação de primórdios radiculares. As maiores percentagens de formação de calos foram obtidas nas concentrações 20,31 μM (88,0 %), 13,54 μM (85,3 %) e 27,08 μM (74,7 %). O maior incremento de massa fresca de calo foi verificado em 13,54 μM de picloram (402,5 mg). Os calos formados foram inoculados em Erlenmeyer (125 mL) contendo 20 mL de meio de MS líquido, suplementado de 4,44 μM de dicamba, 2,4-D ou picloram, onde foram avaliadas quatro diferentes origens de calos da etapa de indução de calos para o estabelecimento: 13,54 μM de dicamba (T1), 13,54 μM de 2,4-D (T2), 13,54 μM de picloram (T3) ou 20,31 μM de picloram (T4). Após seis subculturas de 30 dias cada, T3 e T4 apresentaram melhores índices de estabelecimento (100 % e 83,3 %, respectivamente), incremento da massa fresca e massa seca dos cultivos celulares em suspensão. A partir de análise citoquímica, os cultivos em T3 e T4 apresentaram aglomerados de células avermelhadas, o que as qualifica como positivas quanto à viabilidade embriogênica, conferindo à esses tratamentos as melhores condições de cultivo para tal finalidade. Num segundo capítulo, segmentos nodais de plantas cultivadas in vitro da espécie Guadua aff. chaparensis foram inoculados em meio de cultura de MS com 2,4-D e picloram, nas concentrações 11,1 μM ou 22,2 μM para indução da embriogênese somática. Após 120 dias de cultivo, foram observados quatro calos morfologicamente distintos: (1) gelatinosos em 11,1 μM de 2,4-D, (2) compactos em 22,2 μM de 2,4-D, (3) friáveis em 11,1 μM de picloram e (4) compactos nodulares em 22,2 μM de picloram. Nos calos friáveis foi observado a formação de pró-embriões, uma característica decisiva para a progressão de embriões somáticos, e também a presença de grãos de amido. Os calos friáveis foram submetidos a cultura líquida sob agitação para a obtenção de cultivos celulares em suspensão nos tratamentos T1- controle, T2- 4,44 μM de 2,4-D, T3- 4,44 μM de picloram ou T4- combinação das auxinas. Todos os tratamentos proporcionaram células com viabilidade embriogênica verificadas com a análise citoquímica, exceto T1- controle. Após o estabelecimento e a multiplicação das culturas celulares, foi realizado o restabelecimento de calos, a partir de alíquotas de 20 μL dos cultivos ressuspendidas em meio de MS nos tratamentos com 2,4-D e picloram, nas concentrações de 0; 6,77; 13,54; 20,31 e 27,08 μM. Tais calos apresentaram aspecto friável e, a partir da análise anatômica, foram observados pró-embriões somáticos. Por fim, num terceiro capítulo, realizou-se a multiplicação de propágulos vegetativos de G. magna em diferentes sistemas de cultivo in vitro: T1 MLC- Meio Líquido Convencional; T2 MLA- Meio sob Agitação, T3 BIPER- Biorreatores de Imersão Permanente e T4 BIT- Biorreator de Imersão Temporária. Após 90 dias de cultivo, BIPER e BIT apresentaram maiores médias de sobrevivência dos propágulos em cultivo, número de brotações, altura de brotações e massa fresca, bem como conteúdo de clorofila a, b e carotenóides. A partir da análise de extravasamento de eletrólitos, foi possível verificar que em todos os tratamentos os danos à membrana foram relativamente baixos nos sistemas de cultura (≤ 33,5), exceto no T2-MLA (60,4). Na análise dos componentes bioquímicos (AST/Amido), as mudas de G. magna cultivadas em T3-BIPER e T4-BIT, consumiram em maior quantidade suas reservas de carboidratos (AST). A análise anatômica revelou a presença de regiões meristemáticas, células de primórdios foliares e radiculares, e meristema apical de caule, ou seja, que as mudas propagadas continham a estrutura celular básica necessária para o desenvolvimento de novos brotos e raízes. Também foi possível visualizar a conexão entre o sistema vascular do caule e as folhas, onde um ou mais feixes vasculares são orientados para as folhas. Quanto à aclimatização, as melhores taxas de sobrevivência foram obtidas das plantas de G. magna advindas dos tratamentos T3-BIPER e T4-BIT, com ocorrência de enraizamento adventício espontâneo. Para análise da fidelidade genética, a partir de marcadores moleculares ISSR’s, os indivíduos analisados apresentaram entre si 100 % de similaridade em todos tratamentos, e os somaclones diferiram em média menos de 0,2 %. Conclui-se que, as informações inéditas geradas neste trabalho podem ser úteis para contribuir no entendimento dos aspectos biológicos, fisiológicos e bioquímicos durante o processo de cultivo in vitro de G. magna e G. aff. chaparensis e assim também para o aperfeiçoamento da multiplicação clonal em sistemas de cultivo in vitro, inclusive para outras espécies de bambu. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAP/DF). This work aimed to improve in vitro clonal multiplication techniques of Guadua magna and Guadua aff. chaparensis, developing studies related to callogenesis, somatic embryogenesis and cells suspension culture, in addition to evaluating the application of bioreactors in stages of the process. Anatomical and histochemical investigations, in addition to molecular analyzes, were also carried out to better characterize the different steps involved in the processes studied. Therefore, initially, induction was performed the callogenesis in explants that consisted of nodal segments, internodal segments and leaf sheaths of plants established in vitro of G. magna. The explants were submitted to MS medium culture supplemented with dicamba, 2,4-D or picloram in concentrations of 0; 6.77; 13.54; 20.31 and 27.08 μM. At 60 days of cultivation, it was found that all treatments showed yellowish-white calli and mucilaginous appearance. The histological analysis revealed meristematic zones with cells in intense division and formation of adventicius roots. The highest average percentages of calli formation were obtained in the concentrations 20.31 μM (88.0 %), 13.54 μM (85.3 %) and 27.08 μM (74.7%). The highest increment of fresh mass of calli was verified in 13.54 μM of picloram (402.5 mg). The calli formed were inoculated into Erlenmeyer flasks (125 mL) containing 20 mL of liquid MS medium, supplemented with 4.44 μM dicamba, 2.4-D or picloram, which were evaluated four different calli origins to induction calli step to establishment: 13.54 μM dicamba (T1), 13.54 μM 2.4-D (T2), 13.54 μM picloram or 20.31 μM picloram (T4). After six subcultures of 30 days each, T3 and T4 showed better rates of establishment (100 % and 83.3 %), increase in fresh mass and dry mass of the cell suspension cultures. From cytochemical analysis, cultures in T3 and T4 showed a greater cluster of reddish cells, which qualifies them as positive in terms of embryogenic viability, giving these treatments the best culture conditions for this purpose. In a second chapter, nodal segments of the species of G. aff. chaparensis were inoculated into MS medium with 2,4-D and picloram, in concentrations of 11.1 μM or 22.2 μM to induce somatic embryogenesis. After 120 days of cultivation, four morphologically distinct calli were observed: (1) gelatinous in 11.1 μM of 2,4-D, (2) compact in 22,2 μM of 2,4-D, (3) friable in 11.1 μM picloram and (4) nodular compacts in 22.2 μM picloram. In friable calli, the formation of pro-embryos was observed, a decisive characteristic for the progression of somatic embryos, and also the presence of starch grains. The friable calli were subjected to liquid culture under agitation to obtain cell suspension cultures in the treatments T1- control, T2- 4.44 μM of 2.4-D, T3- 4.44 μM of picloram or T4- in combination with auxins. All treatments provided cells with embryogenic viability verified with cytochemical analysis, except T1- control. After the multiplication of cultures, calli recovery was performed, using aliquots of 20 μL of the cultures resuspended in MS medium in the treatments with 2,4-D and picloram, in the concentrations of 0; 6.77; 13.54; 20.31 and 27.08 μM. Such calli showed a friable aspect and, from the anatomical analysis, somatic pro-embryos were observed. Finally, in a third chapter, it was realized the multiplication of vegetative propagules of G. magna in different in vitro culture systems: T1 CLM- Conventional Liquid Medium, T2 LMA- Medium under Agitation, T3 PERIB- Permanent Immersion Bioreactors and T4 TIB- Temporary Immersion Bioreactor. After 90 days of cultivation, PERIB and TIB showed higher means of the vegetatives propagules survival, number of shoots, size of shoots and mass fresh, as well as chlorophyll content a, b and carotenoids. Through the analysis of electrolyte leakage, it was possible to verify that in all treatments the damage to the membrane was relatively low in the culture systems (≤ 33.5), except T2-LMA (60.4). In the analysis of the biochemical components (AST / Starch), the G. magna seedlings grown in T3- PERIB and T4-TIB, consumed their carbohydrate reserves (AST) in greater quantity. The anatomical analysis revealed that the propagated seedlings contained the basic cellular structure necessary for the development of new shoots and roots and also evidenced the presence of meristematic regions, cells of leaf and root pimordial, and stem apical meristem. It was also possible to visualize the connection between the vascular system of the stem and the leaves, where one or more vascular bundles are oriented towards the leaves. As for acclimatization, the optimal survival rates were obtained from the G. magna plants from T3-PERIB and T4- TIB, with the occurrence of spontaneous adventitious rooting. For genetic fidelity analysis, using ISSR's molecular markers, the individuals analyzed showed 100 % similarity in all treatments, and the somaclones differed on average less than 0.2 %. It is concluded that the new information generated in this study can be useful to contribute to the understanding of the biological, physiological and biochemical aspects during the in vitro cultivation process of G. magna and G. aff. chaparensis, as well as the improvement of in vitro clonal multiplication in cultivation systems, including other bamboo species. 2021-11-04T16:35:32Z 2021-11-04T16:35:32Z 2021-11-04 2020-07-28 Tese QUEIROZ, Fernanda Furlan. Estabelecimento e Cultivo de Células em Suspensão e Uso de Biorreatores como Estratégias de Propagação de Bambus do Gênero Guadua. 2020. 208. f., il. Tese (Doutorado em Botânica)—Universidade de Brasília, Brasília, 2020. https://repositorio.unb.br/handle/10482/42251 Português Acesso Aberto A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data. application/pdf
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