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Expressão Heteróloga da Proteína SM 10.3 em Sistema de Expressão Baculovírus

Dissertação (mestrado) — Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-graduação em Medicina Tropical, 2021.

Main Author: Jesus, Paloma Abreu de
Other Authors: Martins, Vicente de Paulo
Format: Dissertação
Language: Português
Published: 2021
Subjects:
Esquistossomose
MEG-4
Expressão proteica
Bac-to-Bac
Poliedrina
Online Access: https://repositorio.unb.br/handle/10482/42280
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spelling ir-10482-422802021-11-04T18:27:16Z Expressão Heteróloga da Proteína SM 10.3 em Sistema de Expressão Baculovírus Jesus, Paloma Abreu de Martins, Vicente de Paulo Silva, Leonardo Assis da Esquistossomose MEG-4 Expressão proteica Bac-to-Bac Poliedrina Dissertação (mestrado) — Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-graduação em Medicina Tropical, 2021. O Schistosoma mansoni é um helminto que parasita o intestino e vasos sanguíneos de seu hospedeiro mamífero, gerando vários agravos para a saúde do hospedeiro, podendo levar a morte. Uma proteína presente nas glândulas esofágicas do S. mansoni, a Sm10.3, expressa em bactérias, demonstrou ação protetiva em testes com animais, podendo se tornar uma boa candidata para o desenvolvimento de novas vacinas. Assim, seria interessante expressá-la em um sistema eucarioto, como o sistema Bac-to- Bac. Este sistema de expressão utiliza o baculovírus infectando células de insetos. Nesse sistema, o geneSm10.3 foi expresso sob o promotor da poliedrina, que é altamente expresso neste sistema. O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão da proteína Sm10.3 no sistema Bac-to-Bac. O cDNA de S. Mansoni foi clonado em pGEM-T Easy. Os clones obtidos foram subclonados no vetor pFastBac Amino. Após isso o gene recombinado foi clonado em células DH10Bac para geração do bacmídio recombinante. As células de insetos foram transfectadas com os bacmídios recombinantes com o auxílio de lipossomo catiônico. As proteínas recombinantes foram expressas em células de inseto. Apenas um clone da proteína recombinante foi reconhecido por anticorpos anti-6xHis, por western blot. Nele foram detectadas duas proteínas de tamanhos distintos, uma com o tamanho esperado de 21 kDa e outra menor, de aproximadamente 15 kDa, hipoteticamente gerada após o transcrito ter sofrido splicing. Observou-se que as proteínas recombinantes não foram fusionadas à proteína da poliedrina. Este trabalho atingiu o objetivo de clonar e expressar o gene Sm10.3 em sistema de expressão baculovírus, mostrando a eficácia deste sistema para a produção de proteínas heterólogas. Schistosoma mansoni is a helminth that parasitizes the intestine and blood vessels of its mammalian host, causing several damages to the host's health, which can lead to death. A protein present in the esophageal glands of S. mansoni, Sm10.3, expressed in bacteria, has shown protective action in animal tests, and may become a good candidate for the development of new vaccines. Thus, it would be interesting to express it in a eukaryotic system, such as the Bac-to-Bac system. This expression system uses the baculovirus to infect insect cells. In this system, the Sm10.3 gene was expressed under the polyhedrin promoter, which is highly expressed in this system. The objective of this work was to evaluate the expression of Sm10.3 protein in the Bac-to-Bac system. The S. mansoni cDNA was cloned into pGEM-T Easy. The clones obtained were subcloned into the pFastBac Amino vector. After that, the recombined gene was cloned in DH10Bac cells to generate the recombinant bacmid. Insect cells were transfected with recombinant bacmids with the aid of a cationic liposome. Recombinant proteins were expressed in insect cells. Only one clone of the recombinant protein was recognized by anti-6xHis antibodies, by western blot. In it, two proteins of different sizes were detected, one with the expected size of 21 kDa and the other smaller, of approximately 15 kDa, hypothetically generated after the transcript had undergone splicing. It was observed that the recombinant proteins were not fused to the polyhedrin protein. This work achieved the objective of cloning and expressing the Sm10.3 gene in a baculovirus expression system, showing the effectiveness of this system for the production of heterologous proteins 2021-11-04T18:27:16Z 2021-11-04T18:27:16Z 2021-11-04 2021-06-24 Dissertação JESUS, Paloma Abreu de. Expressão Heteróloga da Proteína SM 10.3 em Sistema de Expressão Baculovírus. 2021. 105 f., il. Dissertação (Mestrado em Medicina Tropical) — Universidade de Brasília, Brasília, 2021. https://repositorio.unb.br/handle/10482/42280 Português Acesso Aberto A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data. application/pdf
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