Análise in vitro da co-expressão e efeito do microRNA-9 (miR-9-5p) em genes ligados à Calcificação Cerebral Primária Familiar
Calcificação Cerebral Primária Familiar (CCPF) é uma doença neurológica caracterizada por depósitos de fosfato de cálcio nos gânglios basais e outras regiões cerebrais sendo frequentemente associada com alterações motoras e comportamentais. Mutações nos genes SLC20A2, PDGFB, PDGFRB e XPR1 estão asso...
| Main Author: | BEZERRA, Darlene Paiva |
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| Other Authors: | OLIVEIRA, João Ricardo Mendes de |
| Format: | doctoralThesis |
| Language: | por |
| Published: |
Universidade Federal de Pernambuco
2019
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| Subjects: | |
| Online Access: |
https://repositorio.ufpe.br/handle/123456789/30928 |
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| Summary: |
Calcificação Cerebral Primária Familiar (CCPF) é uma doença neurológica caracterizada por depósitos de fosfato de cálcio nos gânglios basais e outras regiões cerebrais sendo frequentemente associada com alterações motoras e comportamentais. Mutações nos genes SLC20A2, PDGFB, PDGFRB e XPR1 estão associadas à CCPF e são preditos como alvo para alguns agentes reguladores, como os microRNAs (miRNAs). MiRNAs são pequenas sequências de RNAs não codificantes que regulam negativamente a expressão gênica no nível pós-transcricional. O MiRNA-9 (miR-9) é um tipo de miRNA seletivamente expresso em tecidos neuronais que desempenha um papel essencial no desenvolvimento neuronal e sabidamente regula a expressão de PDGFR-beta em cardiomiócitos. Nosso objetivo foi observar a influência do miR-9-5p no desenvolvimento ou aprimoramento da calcificação in vitro, focado nos genes ligados à CCPF. Um estudo in silico, utilizando os softwares online TargetScan e DianaTools, foi feito para verificar se o miR-9-5p regula genes envolvidos na CCPF. As células utilizadas no modelo in vitro foram as SaOs-2 (osteosarcoma) e HEK293 (embrionária renal) foram mantidas em DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium) suplementado com 10% de soro bovino fetal, 0,5% de glutamina 200 mM e 10,000 U/mL de penicilina/estreptomicina. O meio osteogênico é composto do meio de manutenção adicionado de ácido ascórbico 250 μM e 1 mMβ-glicerofosfato como modelo para a calcificação. O meio das células cultivadas foi substituído a cada 3 dias, exceto o ácido ascórbico que foi adicionado todos os dias. A identificação e quantificação de marcadores de osteoblastos (coloração de citoquímica – Alizarin Red) foram realizadas nos dias 0, 7 e 14. Verificamos a co-expressão do o miR-9-5p em genes envolvidos na CCPF através da transfecção em células durante 24hutilizando lipofectamina 2000.O processo de calcificação e co-expressão foram analisados por qPCR e western blotting. Foi feito um estudo eletrofisiológico para verificar a funcionalidade do miR-9-5p em células SaOs-2. Observamos que durante o processo de calcificação o perfil de expressões de genes envolvidos na CCPF é alterado. Com 14 dias de calcificação, comprovado com o Alizarin Red, o miR-9-5p mostrou uma tendência a aumentar com a proteína PiT2 (SLC20A2) diminuída, comprovando a regulação predita. Com o aumento da expressão do o miR-9-5p, observamos uma significante diminuição do PiT2 e PDGFrB. O uso de um inibidor de o miR-9-5p confirmou os achados prévios. Dados adicionais eletrofisiológicos mostraram a atuação, após 24h de transfecção, do miR-9-5p alterando o perfil nas correntes de entradas e saídas de membrana, mostrando uma atuação mais efetiva via canais de potássio e sódio dependente de voltagem. Concluímos que o miR-9-5p é um importante regulador de genes envolvidos no CCPF, durante a calcificação, podendo ser uma via de estudo para entender melhor o processo de calcificação e um potencial alvo terapêutico. |
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