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Purificação, caracterização e avaliação de atividade antimicrobiana de lectina de folha de Bixa orellana L.

Bixa orellana L. é uma planta proveniente das regiões tropicais da América. As lectinas são proteínas que se ligam a carboidratos e exibem diversas atividades biológicas. O presente trabalho descreve a purificação e caracterização de uma lectina extraída das folhas de B. orellana (BoLL, do inglês B....

Full description

Main Author: AMORIM, Poliana Karla
Other Authors: NAPOLEÃO, Thiago Henrique
Format: masterThesis
Language: por
Published: Universidade Federal de Pernambuco 2019
Subjects:
Lectina
Urucum
Atividade bacteriana
Online Access: https://repositorio.ufpe.br/handle/123456789/33302
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spelling ir-123456789-333022019-10-26T07:04:13Z Purificação, caracterização e avaliação de atividade antimicrobiana de lectina de folha de Bixa orellana L. AMORIM, Poliana Karla NAPOLEÃO, Thiago Henrique PAIVA, Patrícia Maria Guedes http://lattes.cnpq.br/3308113573759852 http://lattes.cnpq.br/0869167120016962 Lectina Urucum Atividade bacteriana Bixa orellana L. é uma planta proveniente das regiões tropicais da América. As lectinas são proteínas que se ligam a carboidratos e exibem diversas atividades biológicas. O presente trabalho descreve a purificação e caracterização de uma lectina extraída das folhas de B. orellana (BoLL, do inglês B. orellana leaf lectin) e a avaliação da atividade antimicrobiana. As proteínas foram extraídas da farinha das folhas através de homogeneização (16 h, 4ºC) em NaCl 0,15 M. O extrato obtido foi avaliado quanto à presença de lectinas através do ensaio de atividade hemaglutinante (AH) e tratado com sulfato de amônio (60% de saturação) durante 4 h a 28 ºC. A fração de proteínas precipitadas (FP) e a fração sobrenadante (FS) foram dialisadas e avaliadas quanto à concentração de proteínas e AH. FP (fração com maior AH específica) foi submetida ao ensaio de inibição da AH por carboidratos e glicoproteínas e, em seguida, submetida a cromatografias em coluna de troca iônica (CM-Sephadex) e de exclusão molecular (Sephadex G-75), sendo as frações coletadas monitoradas quanto à AH e absorbância a 280 nm. BoLL foi caracterizada quanto ao perfil eletroforético em gel de poliacrilamida sob condições desnaturantes (SDS-PAGE), estabilidade frente a variações de temperatura e pH e resposta da AH à presença de íons. Atividade antibacteriana de BoLL foi investigada contra patógenos humanos e contra fitopatógenos. Atividade antifúngica de BoLL foi investigada contra Candida albicans, Candida krusei, Candida tropicalis e Candida parapsilosis. O extrato de folhas apresentou AH específica de 47,0. FP apresentou AH específica de 588,9 (fator de purificação: 12,52), a qual foi inibida pelas glicoproteínas fetuína e albumina sérica bovina, pelos monossacarídeos L (+)-arabinose, D(+)-galactose, D(+)-glicose e N-acetil-D-glicosamina, e pelo dissacarídeo lactose. Cromatografia de FP em coluna de CM-Sephadex resultou em um pico (P1) de proteínas não-adsorvidas com AH específica de 1.252 e um pico (P2) de proteínas adsorvidas e eluídas com NaCl 1,0 M que não foram capazes de aglutinar eritrócitos. Cromatografia de P1 em coluna Sephadex G-75 resultou em dois picos, sendo que o primeiro apresentou maior AH específica (2.533) e foi denominado BoLL, que apresentou uma única banda polipeptídica de aproximadamente 19 kDa em SDS-PAGE. A lectina teve sua AH aumentada na presença de íons Mg⁺² e manteve sua capacidade de aglutinar eritrócitos mesmo após aquecimento a 100 ºC. A AH de BoLL foi estável em pH ácido (4,0 a 6,0), mas perdida quando incubada em pH acima de 8,0. BoLL apresentou efeitos bacteriostático e bactericida contra E. coli (CMI: 400 μg/mL e CMB: 800 μg/mL) e S. aureus (CMI e CMB: 400 μg/mL), bem como bacteriostática contra B. megaterium (CMI: 18,2 μg/mL) e M. luteus (CMI: 800 μg/mL). A lectina não foi ativa sobre as bactérias fitopatogênicas e sobre as espécies de Candida. Em conclusão, as folhas de B. orellana contêm uma lectina termoestável com atividade antibacteriana sobre patógenos humanos, o que estimula estudos futuros visando sua aplicação farmacológica. CNPq Bixa orellana L. is a plant from the tropical regions of America. Lectins are proteins that bind to carbohydrates and exhibit various biological activities. The present work describes the purification and characterization of a lectin extracted from the leaves of B. orellana (BoLL), as well as the evaluation of its antimicrobial activity. Proteins were extracted from the leaf powder by homogenization (16 h, 4 °C) in 0.15 M NaCl. The extract obtained was evaluated for the presence of lectins by the hemagglutinating activity (HA) assay and treated with ammonium sulphate (60% saturation) for 4 h at 28 °C. The precipitated protein fraction (PF) and the supernatant fraction (SF) were dialyzed and evaluated for protein concentration and HA. PF (fraction with higher specific HA) was used in HA inhibition assay with carbohydrates and glycoproteins and then submitted to ion exchange (CM-Sephadex) and size exclusion (Sephadex G-75) chromatographies. The collected fractions were monitored for HA and absorbance at 280 nm. BoLL was characterized for profile in electrophoresis in polyacrylamide gel under denaturing conditions (SDS-PAGE), stability to temperature and pH variations and response of its HA to the presence of ions. Antibacterial activity of BoLL was investigated against human pathogens and against phytopathogens. Antifungal activity of BoLL was investigated against Candida albicans, Candida krusei, Candida tropicalis and Candida parapsilosis. Leaf extract showed specific HA of 47.0. PF showed specific HA of 588.9 (purification factor: 12.52), which was inhibited by the glycoproteins fetuin and bovine serum albumin, by the monosaccharides L (+)-arabinose, D(+)-galactose, D(+)-glucose and N-acetyl-D-glucosamine, and by the disaccharide lactose. Chromatography of PF on CM-Sephadex column resulted in a peak (P1) of non-adsorbed proteins with specific HA of 1,252 and a peak (P2) of proteins adsorbed and eluted with 1.0 M NaCl that were not able to agglutinate erythrocytes. Chromatography of P1 on Sephadex G-75 column resulted in two peaks, the first of which presented a higher specific HA (2,533) and was named BoLL, which presented a single polypeptide band of approximately 19 kDa on SDS-PAGE. The lectin had its HA increased in the presence of Mg²⁺ ions and maintained its capacity to agglutinate erythrocytes even after heating to 100 °C. The AH of BoLL was stable at acidic pH, but lost when incubated at pH above 8.0. BoLL showed bacteriostatic and bactericidal effects against E. coli (MIC: 400 μg/mL and MBC: 800 μg/mL) and S. aureus (MIC and MBC: 400 μg/mL), as well as bacteriostatic effects against B. megaterium (MIC: 18.2 μg/mL) and M. luteus (MIC: 800 μg/mL). The lectin was not active on phytopathogenic bacteria and on Candida species. In conclusion, the leaves of B. orellana contain a thermostable lectin with antibacterial activity on human pathogens, which stimulates future studies aiming at its biomedical application. 2019-09-19T19:33:49Z 2019-09-19T19:33:49Z 2018-02-23 masterThesis https://repositorio.ufpe.br/handle/123456789/33302 por embargoedAccess Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/ application/pdf Universidade Federal de Pernambuco UFPE Brasil Programa de Pos Graduacao em Bioquimica e Fisiologia
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