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Avaliação funcional de polimorfismos do oncogene E6 do Papilomavírus humano 31

Existem cerca de 200 tipos de HPV, dos quais 40 acometem o trato genital, e 15 deles são considerados de alto risco oncogênico, dentre eles, o HPV-31, que é inclusive, o segundo mais frequente em Pernambuco. As oncoproteínas E6 e E7 são responsáveis pela atividade transformante dos HPVs de alto risc...

Full description

Main Author: SANTOS, Daffany Luana dos
Other Authors: FREITAS, Antonio Carlos de
Format: masterThesis
Language: por
Published: Universidade Federal de Pernambuco 2019
Subjects:
Papilomavirus humano
Câncer – Aspectos genéticos
Útero – Câncer
Online Access: https://repositorio.ufpe.br/handle/123456789/34581
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id ir-123456789-34581
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spelling ir-123456789-345812019-10-15T05:09:47Z Avaliação funcional de polimorfismos do oncogene E6 do Papilomavírus humano 31 Avaliação funcional de polimorfismos do oncogenese E6 do Papilomavírus humano 31 SANTOS, Daffany Luana dos FREITAS, Antonio Carlos de CHAGAS, Bárbara Simas LIMA, Rita de Cássia Pereira de http://lattes.cnpq.br/0221502084122001 http://lattes.cnpq.br/3473903684822728 http://lattes.cnpq.br/3105282471569957 http://lattes.cnpq.br/6503103965992596 Papilomavirus humano Câncer – Aspectos genéticos Útero – Câncer Existem cerca de 200 tipos de HPV, dos quais 40 acometem o trato genital, e 15 deles são considerados de alto risco oncogênico, dentre eles, o HPV-31, que é inclusive, o segundo mais frequente em Pernambuco. As oncoproteínas E6 e E7 são responsáveis pela atividade transformante dos HPVs de alto risco. Através de estudos epidemiológicos foi estabelecida a relação entre os tipos de HPV e câncer cervical. Este estudo teve como objetivo, checar o efeito das variantes no oncogene E6 do HPV-31 presentes em Pernambuco (Nordeste, Brasil), inferindo a importância clínica com relação à oncogenicidade do câncer de colo uterino. Os polimorfismos estudados para E6 HPV-31 foram identificados pelo nosso grupo de pesquisa. As amostras foram sub-clonadas em vetor pCI neo para expressão em células de mamíferos. As amostras clonadas foram sequenciadas e alinhadas com a sequência de referência do HPV-31. As construções apresentando os vetores recombinantes contendo E6 foram utilizadas para transfecção de células HEK293. Para investigar os efeitos dos polimorfismos presentes em E6 na via NF-κB, as células foram transfectadas com o vetor de expressão contendo as variantes H60Y, T64A, K123R, A138V, R144G e o Full (amostra apresentando todas as variantes), com o plasmídeo repórter de luminescência (κB) 3-Luc e com o plasmídeo normalizador de luminescência pRenilla, e com o protótipo de E6 do HPV-31(sequência sem nenhum polimorfismo). Para avaliar os efeitos obtidos, nossas construções foram comparadas com a sequência protótipo, e o vetor vazio que foi usado como controle positivo da ativação da via. Após a transfecção as células foram lisadas, os extratos celulares foram preparados para leitura da luciferase de firefly e renilla as quais determinaram o fold da via NF-κB. Foi encontrada diferença estatisticamente significativa entre E6 R144G. Porém para a variante T64A houve uma regulação negativa significante na atividade da via, também em conjunto, os polimorfismos apresentaram uma diminuição na atividade de NF-kB. Para a análise da atividade transcricional de E6, a variante R144G, apresentou uma expressão muito baixa de RNAm. Enquanto a variante T64A apresentou níveis aumentados de expressão relativa. Este estudo corrobora com dados já existentes na literatura sobre os polimorfismos. Além de contribuir para expansão do conhecimento acerca de alterações nucleotídicas no oncogene E6 e seu papel na imortalização celular. CAPES There are about 200 HPV types, 40 of which involve the genital tract, and 15 of them are considered to be at high risk for oncogenic HPV 31, which is the second most common in Pernambuco. The relationship between HPV types and cervical cancer was established through epidemiological studies. The objective of this study was to verify the effect of the variants on HPV31 E6 oncogene present in Pernambuco (Northeastern Brazil), inferring the clinical importance regarding the oncogenicity of cervical cancer. The E6 and E7 oncoproteins are responsible for the transforming activity of high-risk HPVs. The polymorphisms studied for E6 HPV-31 were identified by our research group. Samples were subcloned into neo pCI vector for expression in mammalian cells. The cloned samples were sequenced and aligned with the HPV-31 reference sequence. The constructs showing recombinant E6-containing vectors were used for transfection of HEK293 cells. To investigate the effects of polymorphisms present in E6 on the NF-κB pathway, the cells were transfected with the expression vector containing the H60Y, T64A, K123R, A138V, R144G and Full variants (the all-variant sample) with the plasmid (κB) 3-Luc reporter and with the pRenilla luminescence normalizing plasmid, and with the HPV-31 E6 prototype. To evaluate the effects obtained, our constructions were compared with the prototype sequence, and the empty vector that was used as positive control of the pathway activation. After transfection the cells were lysed, the cell extracts were prepared for reading of the firefly and renilla luciferase which determined the folding of the NF-κB pathway. For the analysis of transcriptional activity of E6, the R144G variant showed very low mRNA expression. While the T64A variant showed increased levels of relative expression. This study corroborates data already available in the literature on polymorphisms. In addition to contributing to the expansion of knowledge about nucleotide changes in E6 oncogene and its role in cell immortalization. 2019-10-14T19:21:19Z 2019-10-14T19:21:19Z 2019-02-25 masterThesis https://repositorio.ufpe.br/handle/123456789/34581 por embargoedAccess Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/ application/pdf Universidade Federal de Pernambuco UFPE Brasil Programa de Pos Graduacao em Inovacao Terapeutica
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SANTOS, Daffany Luana dos
Avaliação funcional de polimorfismos do oncogene E6 do Papilomavírus humano 31
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