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Desenvolvimento de bioconjugados constituídos por pontos quânticos e a lectina ligadora de manose

Desenvolvimento de bioconjugados constituídos por pontos quânticos e a lectina ligadora de manose Pontos quânticos (PQs) se tornaram valiosas ferramentas para diversos estudos biológicos devido às suas propriedades únicas, como a alta fotoestabilidade, e por apresentar uma superfície quimicamente at...

Full description

Main Author: SILVA, Paloma Manuelle Marques da
Other Authors: FONTES, Adriana
Format: masterThesis
Language: por
Published: Universidade Federal de Pernambuco 2020
Subjects:
Nanopartículas
Fluorescência
Carboidratos
Online Access: https://repositorio.ufpe.br/handle/123456789/38018
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id ir-123456789-38018
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spelling ir-123456789-380182020-09-17T05:15:22Z Desenvolvimento de bioconjugados constituídos por pontos quânticos e a lectina ligadora de manose SILVA, Paloma Manuelle Marques da FONTES, Adriana LIMA, Carinna Nunes de http://lattes.cnpq.br/4238101817083251 http://lattes.cnpq.br/8006395717703055 http://lattes.cnpq.br/2104569068911073 Nanopartículas Fluorescência Carboidratos Desenvolvimento de bioconjugados constituídos por pontos quânticos e a lectina ligadora de manose Pontos quânticos (PQs) se tornaram valiosas ferramentas para diversos estudos biológicos devido às suas propriedades únicas, como a alta fotoestabilidade, e por apresentar uma superfície quimicamente ativa que possibilita sua conjugação a biomoléculas, como lectinas. Conjugados de PQ-lectinas têm sido utilizados como sondas versáteis não só para o estudo do papel dessas biomoléculas como também para avaliar o perfil de carboidratos em diferentes sistemas biológicos, fornecendo valiosas informações a respeito da sua glicobiologia. A lectina ligadora de manose (MBL) é uma molécula que atua no sistema imune inato reconhecendo carboidratos como N-acetil-D-glicosamina, D-manose e L-fucose expressos nas superfícies de patógenos, e participa de processos biológicos, tais como ativação do complemento, opsonização, modulação da inflamação e depuração de células apoptóticas. Assim, este trabalho objetivou desenvolver um conjugado eficiente e específico constituído por MBL e PQs de CdTe. Para tanto, a adsorção – em vários pHs – e a ligação covalente em pH 6,0 foram avaliadas como estratégias de conjugação, sendo as leveduras de Candida albicans utilizadas como prova de conceito. Na conjugação foi utilizada uma MBL recombinante (rhMBL). Os resultados de citometria de fluxo evidenciaram que o conjugado preparado por adsorção em pH 6,0 foi o que marcou mais efetivamente as leveduras, apresentando a maior porcentagem e maior mediana de fluorescência, e, por isso foi escolhido para ser caracterizado quanto à especificidade e às propriedades ópticas. A especificidade foi analisada a partir de ensaios de inibição do conjugado pelo açúcar D-(+)-manose na presença de cálcio (sistema 1), com incubações sem a adição de cálcio (sistema 2), bem como com solução contendo o quelante EDTA (sistema 3). A caracterização óptica indicou que o conjugado escolhido apresentou com intensa fluorescência. Os resultados de citometria de fluxo confirmaram que esta nanossonda (adsorção em pH 6,0) foi capaz de marcar praticamente 100% das leveduras. Essa marcação reduziu para cerca de 15,1% para o sistema 1 e para 13,8% para o sistema 2, enquanto para o sistema 3, a marcação das células não foi praticamente observada, sendo menor que 1%. Esses dados evidenciaram que o conjugado foi específico e que a presença do cálcio foi fundamental para a rhMBL reconhecer as leveduras pelo domínio de reconhecimento de carboidratos. A análise por microscopia de fluorescência confirmou a eficiência do conjugado escolhido, revelando uma marcação homogênea da C. albicans. Assim, o conjugado de PQs-rhMBL, por adsorção em pH 6,0, pode ser considerado uma versátil e promissora ferramenta óptica para a compreensão do papel da MBL em diversos sistemas biológicos. CAPES CNPq Quantum dots (QDs) can be considered valuable tools for a variety of biological studies due to their unique characteristics. QDs have high photostability and chemically active surface for conjugation with biomolecules, such as lectins. QDslectin conjugates have been used as versatile probes not only to understand the role of lectins but also to evaluate the carbohydrate profile in different biological systems, providing valuable information about their glycobiology. Mannose-binding lectin (MBL) is a molecule belonging to the innate immune system, which recognizes carbohydrates as N-acetyl-D-glucosamine, D-mannose, and L-fucose expressed on pathogen surfaces. MBL also takes part in biological processes such as complement activation, opsonization, inflammation modulation, and clearance of apoptotic cells. Thus, this work aimed to develop an efficient and specific conjugate consisted of MBL and CdTe QDs. For this, adsorption – at various pHs – and covalent binding at pH 6.0 were evaluated as conjugation strategies, and Candida albicans yeasts were used as proof of concept. For conjugation, a recombinant human MBL (rhMBL) was used. Flow cytometry results showed that the conjugate prepared by adsorption at pH 6.0 labeled C. albicans yeasts more efficiently, presenting the highest percentage and the highest fluorescence median intensity. Thus, this conjugate was, therefore, chosen to be characterized according to its specificity and optical properties. The specificity of the conjugate was evaluated by inhibition assay, using D-(+)-mannose, in the presence of calcium (system 1), by incubating the conjugates without the addition of calcium (system 2), and also incubating using a solution containing EDTA chelator (system 3). The optical characterization indicated that the chosen conjugate presented intense fluorescence. The flow cytometry results confirmed that this nanoprobe (adsorption at pH 6.0) was capable of labelling almost 100% of yeast cells. The labeling decreased to about 15.1% for system 1 and 13.8% for system 2, while for system 3, cell labeling was practically not observed, being less than 1%. These data show that the conjugate was specific, and the presence of calcium was essential for rhMBL to recognize yeast cells by its CDR domain. Fluorescence microscopy analyses confirmed the efficiency of the chosen conjugate, presenting homogeneous labeling of C. albicans. Thus, QDs-rhMBL conjugate by adsorption at pH 6.0 can be considered a versatile and promising optical tool for understanding the role of MBL in many biological systems. 2020-09-16T18:30:28Z 2020-09-16T18:30:28Z 2020-01-06 masterThesis SILVA, Paloma Manuelle Marques da. Desenvolvimento de bioconjugados constituídos por pontos quânticos e a lectina ligadora de manose. 2020. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) – Universidade Federal de Pernambuco, Recife, 2020. https://repositorio.ufpe.br/handle/123456789/38018 por embargoedAccess Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/ application/pdf Universidade Federal de Pernambuco UFPE Brasil Programa de Pos Graduacao em Ciencias Biologicas
institution REPOSITORIO UFPE
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Desenvolvimento de bioconjugados constituídos por pontos quânticos e a lectina ligadora de manose
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