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Avaliação e caracterização de proteínas antigênicas e de superfície de Leishmania sp. e seu papel no diagnóstico da leishmaniose e na patogenia do parasito

As leishmanioses são doenças infecto-parasitárias causadas por protozoários flagelados da família Trypanosomatidae e gênero Leishmania. Essas doenças apresentam aproximadamente 2 milhões de novos casos anuais mundialmente, com o Brasil representando grande parte deste número. Métodos de diagnóstico...

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Main Author: CASTRO NETO, Artur Leonel de
Other Authors: MELO NETO, Osvaldo Pompílio de
Format: doctoralThesis
Language: por
Published: Universidade Federal de Pernambuco 2019
Subjects:
Leishmaniose
Proteínas
Epidemiologia
Online Access: https://repositorio.ufpe.br/handle/123456789/30597
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spelling ir-123456789-305972019-05-11T05:05:01Z Avaliação e caracterização de proteínas antigênicas e de superfície de Leishmania sp. e seu papel no diagnóstico da leishmaniose e na patogenia do parasito CASTRO NETO, Artur Leonel de MELO NETO, Osvaldo Pompílio de MAGALHÃES, Franklin Barbalho http://lattes.cnpq.br/2317869942236790 http://lattes.cnpq.br/6769466465877287 Leishmaniose Proteínas Epidemiologia As leishmanioses são doenças infecto-parasitárias causadas por protozoários flagelados da família Trypanosomatidae e gênero Leishmania. Essas doenças apresentam aproximadamente 2 milhões de novos casos anuais mundialmente, com o Brasil representando grande parte deste número. Métodos de diagnóstico eficazes e o entendimento da patogênese são essenciais para um combate eficiente da Leishmaniose. Ambos dependem da identificação e caracterização de proteínas antigenicamente relevantes de Leishmania. Este estudo objetivou avaliar proteínas antigênicas previamente selecionadas quanto ao seu potencial para o diagnóstico da leishmaniose visceral provocada por Leishmania infantum e caracterizar a proteína de virulência GP63 de Leishmania sp. de um ponto de vista genético e proteico, observando similaridades e diferenças e suas implicações para o reconhecimento pelo sistema imune. Primeiramente, as proteínas recombinantes foram obtidas através de sistema de expressão em bactérias Escherichia coli, purificadas por colunas de afinidade e quantificadas pelo método de Bradford. As proteínas purificadas foram sensibilizadas em placas de ELISA e avaliadas quanto a seu reconhecimento por soros positivos de humanos e cães infectados por L. infantum, soros de outras enfermidades e soros de indivíduos sadios. A análise dos dados e testes estatísticos foi realizada pelos programas Medcalc e Prism3. A busca por novos parálogos de GP63 foi realizada através do modelo oculto de Markov e ensaios de PCR. A construção de árvores filogenéticas foi realizada a partir de alinhamentos produzidos no MAFFT, editados com o Trimal, avaliados quanto ao modelo evolutivo pelo ProTest e construídas pelo Phyml. As modelagens proteicas foram realizadas a partir de métodos de threading e a predição de epítopos foram obtidas através dos programas AAP12, Bcpred e Bepipred. Como resultados, observamos que proteínas foram identificadas com alto potencial para o diagnóstico da doença canina ou humana, e misturas das melhores proteínas tiveram melhor desempenho na detecção de ambas as formas da doença, sugerindo um teste único para o diagnóstico. Em um segundo momento passou se a investigar o principal antígeno de superfície de espécies de Leishmania, a protease gp63. Identificamos um grande número de parálogos em Leishmania e espécies relacionadas, categorizados em grupos distintos localizados nos cromossomos 10, 28 e 31. Os genes dos dois últimos grupos parecem ser mais próximos de genes encontrados em parasitas de insetos ou plantas, enquanto que os do cromossomo 10 sofreram uma expansão em número de parálogos em Leishmania e em especial em L. braziliensis. Estes foram melhor estudados e apresentaram momentos de expressão distintos, expansão independente na evolução e eventos de recombinação intragênica. Variações de sequência e regiões de predição de anticorpos foram mapeados na superfície externa das proteínas. Esses dados sugerem um papel relevante para a variação antigênica da gp63 na biologia do parasito e na patogenia da doença. CAPES Leishmaniasis are infectious-parasitic diseases caused by flagellate protozoa of the family Trypanosomatidae and genus Leishmania. These diseases cause approximately 2 million new cases annually worldwide, with Brazil accounting for a large part of this number. Effective diagnostic methods and the understanding of the pathogenesis are essential for an effective leishmaniasis control. Both depend on the identification and characterization of antigenically relevant Leishmania proteins. This study aimed to evaluate antigenic proteins previously selected as to their potential for the diagnosis of visceral leishmaniasis caused by Leishmania infantum and to contribute in the Leishmania sp. GP63 virulence protein characterization from a genomic and proteomic approach, observing similarities and differences and their implications for recognition by the immune system. First, the recombinant proteins were obtained by the Escherichia coli expression system, purified by affinity columns and quantified by the Bradford method. The purified proteins were applied on ELISA plates and assessed for recognition by positive sera from humans and dogs infected with L. infantum, sera from other related diseases and sera from healthy individuals. Data analysis and statistical tests were performed by Medcalc and Prism3 programs. The search for new GP63 paralogs was performed using the hidden Markov model and PCR assays. The construction of phylogenetic trees was performed from alignments produced in MAFFT, edited by Trimal, evaluated for the best evolutionary model by ProTest and built by Phyml. Protein modelling was performed using threading methods and prediction of epitopes were obtained through the AAP12, Bcpred and Bepipred programs. As results, we observed that proteins were identified with high potential for the diagnosis of canine or human disease, and mixtures of the best proteins had better performance in the detection of both forms of the disease, suggesting a single test for the diagnosis. In a second moment it was investigated the main surface antigen of Leishmania species, the protease gp63. We identified many paralogs in Leishmania and related species, categorized into distinct groups located on chromosomes 10, 28 and 31. The genes of the latter two groups appear to be closer to genes found in insect or plant parasites, whereas those in the chromosome 10 showed an increase in the number of paralogs in Leishmania and especially in L. braziliensis. These were better studied and presented distinct expression moments, independent expansion in evolution and intragenic recombination events. Sequence variations and regions of antibody prediction were mapped on the outer surface of the proteins. These data suggest a relevant role for the antigenic variation of gp63 in the parasite biology and in the pathogenesis of the disease. 2019-05-10T21:21:53Z 2019-05-10T21:21:53Z 2018-02-28 doctoralThesis https://repositorio.ufpe.br/handle/123456789/30597 por embargoedAccess Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/ Universidade Federal de Pernambuco UFPE Brasil Programa de Pos Graduacao em Genetica
institution REPOSITORIO UFPE
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CASTRO NETO, Artur Leonel de
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