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Produção, caracterização e purificação parcial de uma nova β-Galactosidade produzida por Cladosporium tenuissimum URM 7803

A β-galactosidase (EC3.2.1.23) é classificada como uma hidrolase, e realiza reações de catalisação a partir do resíduo terminal β-galactopiranosil da lactose (Galβ1-4Glc) para formar glicose e galactose. Esta enzima se destaca na indústria de alimentos e farmacêutica, sendo utilizada para hidrólise...

Full description

Main Author: PAULO, Anderson José
Other Authors: PORTO, Ana Lúcia Figueiredo
Format: doctoralThesis
Language: por
Published: Universidade Federal de Pernambuco 2019
Subjects:
Enzimas microbianas
Enzimas de fungos
Online Access: https://repositorio.ufpe.br/handle/123456789/33275
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id ir-123456789-33275
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spelling ir-123456789-332752019-09-20T05:05:35Z Produção, caracterização e purificação parcial de uma nova β-Galactosidade produzida por Cladosporium tenuissimum URM 7803 PAULO, Anderson José PORTO, Ana Lúcia Figueiredo http://lattes.cnpq.br/8836826992943384 http://lattes.cnpq.br/4989617783837981 Enzimas microbianas Enzimas de fungos A β-galactosidase (EC3.2.1.23) é classificada como uma hidrolase, e realiza reações de catalisação a partir do resíduo terminal β-galactopiranosil da lactose (Galβ1-4Glc) para formar glicose e galactose. Esta enzima se destaca na indústria de alimentos e farmacêutica, sendo utilizada para hidrólise da lactose e produção de produtos destinados a intolerantes à lactose, além de ser usada na síntese de galacto-oligossacarídeos (GOS). Neste sentido, este trabalho objetiva a produção, caracterização e purificação parcial de uma nova β-galactosidase produzida por um isolado da espécie Cladosporium tenuissimum URM 7803. O sequenciamento genético do fator de alongamento e tradução (TEF-1) apresentou 88% de suporte para a espécie C. tenuissimum URM 7803 dentro do complexo de espécies C. cladosporioides. Após confirmação da espécie, a produção de β-galactosidase por C. tenuissimum URM 7803 foi realizada utilizando fermentação líquida conduzida a 28 °C, pH 6.5 e 180 rpm por 312h. Um sistema de duas fases aquosas composto por polietilenoglicol-citrato (SDFA–PEG-Citrato) foi feito por planejamento fatorial 2⁴, utilizando como variáveis a massa molar do PEG (400, 3350 e 8000); concentração do PEG (g/L) (20, 22 e 24); concentração de citrato (g/L) (15, 17,5 e 20) e pH (6, 7 e 8). Os resultados mostraram que a maior produção volumétrica de β-galactosidase (462,13 U/mL) ocorreu em 264h. No SDFA-PEG/Citrato o ensaio 2 (MM-PEG 8000, %PEG 20, %citrato 15 e pH 6,0) apresentou um valor significativo de fator de purificação (FP) de 12,82, e a produção da enzima nessas condições foi selecionada para a etapa de caracterização enzimática. A caracterização do extrato bruto e do extrato parcialmente purificado por SDFA, demonstrou respectivamente temperatura e pH ótimos de 35-60º C e 3,0-4,5 para o extrato bruto e, 40-60º C e 3,0-4,5 para o extrato parcialmente purificado. O íon Fe²⁺ aumentou em 38% a atividade enzimática do extrato parcialmente purificado, e os íons Zn²⁺, Cu²⁺ e Co²⁺ reduziram em média, 25% da atividade. Em relação ao efeito dos inibidores e detergentes a atividade enzimática foi aumentada ou mantida, exceto para o Fenilmetilsulfonilflúor (PMSF) que reduziu em 20 e 12% a atividade no extrato bruto e parcialmente purificado, respectivamente. Pode-se concluir que a nova β-galactosidase produzida por C. tenuissimum URM 7803 foi parcialmente purificada pelo SDFA PEG-Citrato, sendo o primeiro estudo utilizando este tipo de sistema para purificação de β-galactosidase, além de ter apresentado boa atividade enzimática durante sua caracterização físico-química, sendo necessário novos estudos para aumentar o grau de pureza. CAPES β-galactosidase (EC3.2.1.23), is classified as a hydrolase, and performs catalytic reactions from the β-galactopyranosyl terminal residue of lactose (Galβ1-4Glc) to form glucose and galactose. This enzyme excels in the food and pharmaceutical industry, being used for hydrolysis of lactose and production of products destined to lactose intolerant, besides being used in the synthesis of galacto-oligosaccharides (GOS). In this sense, this work aims at the production, characterization and partial purification of a new β-galactosidase produced by an isolate of the species Cladosporium tenuissimum URM 7803. The genetic sequencing of the elongation and translation factor (TEF-1) presented 88% support for the species C. tenuissimum URM 7803 within the C. cladosporioides species complex. After confirmation of the species, β-galactosidase production by C. tenuissimum URM 7803 was performed using liquid fermentation conducted at 28º C, pH 6.5 and 180 rpm for 312 h. A two-phase aqueous system composed of polyethylene glycol-citrate (SDFA-PEG-Citrate) was done by factorial design 24, using as variables the PEG molar mass (400, 3350 and 8000); concentration of PEG (g / L) (20, 22 and 24); concentration of citrate (g / L) (15, 17,5 and 20) and pH (6, 7 and 8). The results showed that the highest volumetric production of β-galactosidase (462.13 U / mL) occurred in 264h. In SDFA-PEG/Citrate assay 2 (MM-PEG 8000, %PEG 20, %citrato 15 e pH 6,0) presented a purification factor (PF) of 12.82, and the production of the enzyme under these conditions was selected for the enzymatic characterization step. The characterization of the crude extract extract and partially purified by SDFA showed respectively optimum temperature and pH of 35-60 ° C and 3,0-4,5 for crude extract and 40-60 ° C and 3,0-4,5 for the partially purified extract. The Fe2 + ion increased the enzymatic activity of the partially purified extract by 38%, and the Zn2 +, Cu2 + and Co2 + ions reduced, on average, 25% of the activity. Regarding the effect of the inhibitors and detergents the enzymatic activity was increased or maintained, except for Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), which reduced the activity in the crude and partially purified extract by 20 and 12%, respectively. It can be concluded that the new β-galactosidase produced by C. tenuissimum URM 7803 was partially purified by SDFA PEG-Citrate, being the first study using this type of system for purification of β-galactosidase, besides showing good enzymatic activity during its physico-chemical characterization, being necessary new studies to increase the degree of purity. 2019-09-19T18:34:10Z 2019-09-19T18:34:10Z 2018-02-28 doctoralThesis https://repositorio.ufpe.br/handle/123456789/33275 por embargoedAccess Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/ Universidade Federal de Pernambuco UFPE Brasil Programa de Pos Graduacao em Ciencias Biologicas
institution REPOSITORIO UFPE
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Enzimas de fungos
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PAULO, Anderson José
Produção, caracterização e purificação parcial de uma nova β-Galactosidade produzida por Cladosporium tenuissimum URM 7803
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